|
(mismatch) между матричной ДНК и 3'-концом одного из олигоп-
раймеров (Newton et al.,1989; Bottema et al.,1990 ). Суть
метода заключается в оновременном проведении двух ПЦР, для
каждой из которых одним из праймеров служит аллель-специфи-
ческая мутантная или нормальная олигонуклеотидная последова-
тельность, соответственно. При этом в качестве второго прай-
мера для проведения двух реакций выбирают одну и ту же оли-
гонуклеотидную последовательность, так что в обоих случаях
могут амплифицироваться участки ДНК одинаковой протяжен-
ности.Мутантный сайт в аллель-специфических праймерах распо-
ложен не в центре, а ближе к 3'-концу, и чаще всего занимает
предпоследнюю позицию. При определенных условиях, важнейшим
из которых является концентрация ионов магния в растворе,
наличие сайта негомологичного спаривания в 3'-области прай-
мера препятствует началу синтеза ДНК. Таким образом, при на-
личии мутации в исследуемой матричной ДНК амплифицированные
фрагменты образуются только в том случае, если в качестве
аллель-специфического праймера выбирается мутантная последо-
вательность, тогда как при использовании нормального олиго-
нуклеотидного праймера ПЦР блокируется (Рис.4.9.). Метод на-
шел широкое применение для детекции мутаций при фенилкетону-
рии, бета-талассемии, муковисцидозе, при типировании генов
HLA системы. Однако, сложности в подборе праймеров и в выбо-
ре оптимального режима ПЦР ограничивают широкое применение
этого метода. Вместе с тем, его несомненным преимуществом
является возможность применения полностью автоматического
сканирования.
Таким же преимуществом обладают и методы детекции
состояния гена, основанные на лигировании синтетических оли-
гонуклеотидных зондов- OLA (oligonucleotide ligation assay).
При проведении этих реакций специфические ДНК или РНК после-
довательности исследуют путем использования их в качестве
матрицы для ковалентного связывания двух пар олигонуклеотид-
ных зондов (Landegren,1993). ДНК-зонды для лигирования под-
бирают таким образом, чтобы они были полностью комплементар-
ны нормальному фрагменту ДНК в области локализации мутации,
причем сама нуклеотидная замена должна находиться на стыке
двух праймеров. Обычно в один из зондов вводят радиоактивную
или флюоресцентную метку, а другой - метят биотином. После
гибридизации при строго стандартных условиях синтезированные
олигонуклеотидные последовательности сшивают ДНК-лигазами из
термофильных микроорганизмов. Такие ферменты работают при
высоких температурах и сохраняют свою активность в условиях,
необходимых для проведения денатурации молекул ДНК. При на-
личии мутации в тестируемой молекуле ДНК на конце одного из
зондов образуется сайт некомплементарного спаривания, не-
посредственно примыкающий к месту лигирования. Наличие тер-
минального неспаренного основания в смежно расположенных
последовательностях ДНК-зондов резко снижает скорость лиги-
рования и при определенных условиях проведения реакции сшив-
ки между зондами в этом случае не происходит. Метод включает
несколько последовательных циклов гибридизации, лигирования
и денатурации. Начиная со второго цикла, матричной ДНК для
гибридизации зондов наряду с тестируемой пробой служат также
лигированные последовательности. В дальнейшем проводят
электрофоретический анализ меченых однонитевых фрагментов
ДНК. Система успешно апробирована на мутациях глобиновых ге-
нов при серповидно-клеточной анемии и на мутации delF508 при
муковисцидозе.
Универсальным методом детекции замен оснований является
метод аллель-специфических олигонуклеотидов - ASO, который
включает амплификацию фрагментов ДНК и последующую дот- или
слот-гибридизацию с мечеными аллель-специфическими олигонук-
леотидами (Reiss, 1991). Для этого синтезируют два типа оли-
гонуклеотидных последовательностей обычно размером 19 пар
оснований, в которых мутантный сайт занимает центральное по-
ложение. Каждый из этих олигонуклеотидных зондов комплемен-
тарен нормальному или мутантному вариантам ДНК, соот-
ветственно. Условия гибридизации подбирают таким образом,
чтобы дуплексы образовывались только при полной комплемен-
тарности гибридных пар. В этих условиях амплифицированные
фрагменты ДНК без мутации будут гибридизоваться только с
нормальным зондом, ДНК гомозигот по мутации - только с му-
тантным и ДНК гетерозигот - с обоими олигонуклеотидами
(Рис.4.10). Для уменьшения перекрестной аллель-специфической
гибридизации в реакционную смесь добавляют 30-кратный избы-
ток конкурентного немеченого олигонуклеотидного ДНК-зонда.
Разработаны удобные модификации метода ASO с использованием
аллель-специфических ДНК-зондов, меченых биотином или пе-
роксидазой хрена (Лебедева и др.,1994).
Наиболее быстрым, экономичным и удобным методом скани-
рования точечных мутаций является модифицированный вариант
ASO, так называемая гибридизационная система обратного
дот-блота (reverse dot-blot hybridisation system) (Saiki
et.al.,1989). Метод позволяет одновременно скринировать сра-
зу много точечных мутаций и доступен автоматизации
(Chebab, 1993). В этом случае проводят гибридизацию меченых
продуктов ПЦР, обычно представляющих собой отдельные экзоны,
с фиксированными на нейлоновых фильтрах аллель-специфически-
ми олигонуклеотидными зондами (ASO). Предварительную иммоби-
лизацию мутантных и нормальных ASO-зондов на мембранах осу-
ществляют за счет присоединения гомополимерных T-хвостов с
дезоксирибонуклеотид-трансферазой на конце. При этом олиго-
нуклеотидные последовательности остаются свободными и могут
участвовать в гибридизации с мечеными амплифицированными
фрагментами ДНК. После отмывки несвязавшихся молекул ДНК ра-
диоавтографические или цветные пятна на фильтрах становятся
заметными только в местах локализации олигонуклеотидов, пол-
ностью комплементарных тестируемой геномной ДНК. Реакцию,
обычно проводят в присутствии ионов тетра-алкиламмония,
уменьшающих зависимость температуры плавления от композиции
оснований. Это позволяет использовать одинаковые условия
гибридизации для различных олигонуклеотидов, то есть вести
поиск сразу нескольких типов мутаций, локализованных в одном
и том же экзоне гена. Данный метод положен в основу разра-
ботки специальных систем, предназначенных для одновременной
детекции наиболее распространенных мутаций в исследуемом ге-
не. Система представляет собой ленточный фильтр (стрип) с
нанесенными пятнами олигопраймеров, каждый из которых соот-
ветствует определенной мутации. Стрип помещают в раствор со
смесью тех меченых амплифицированных экзонов, которые могут
содержать тестируемые мутантные аллели и создают условия для
аллель-специфифческой гибридизации. Таким способом сканируют
одновренно 42 мутации, ответственные за серповидноклеточную
анеми, 34 мутации при муковисцидозе (Сhebab,1993)
Очень простой метод обнаружения и идентификации
описанных ранее мутаций в амплифицированных фрагментах ДНК
основан на анализе характера электрофоретического разделения
продуктов ПЦР в MDE-гидросвязывающих гелях в присутствии
высоких концентраций мочевины. Эти гели способствуют форми-
рованию гетеродуплексов в процессе электрофореза, причем
расположение дуплексов очень специфично для различных му-
тантных аллелей, локализованных в одном и том же амплифици-
рованном фрагменте. Это позволяет не только выявлять, но с
высокой степенью вероятности идентифицировать известные му-
тации. В мультиплексном варианте методики возможен одновре-
менный поиск мутаций в нескольких амплифицированных фрагмен-
тах. Простота и высокая скорость анализа способствуют разра-
ботке на основе разделения в MDE-гелях схем максимальной ав-
томатизации процесса поиска и идентификации известных мута-
ций у пациентов и гетерозиготных носителей мутаций
Итак, методы выявления мутаций довольно разнообразны и
постоянно совершенствуются. В первую очередь, молекулярному
анализу подвергают те гены, повреждения которых сопровожда-
ются развитием наиболее частых заболеваний. Исследования
проводят либо в семьях высокого риска, где уже имеются боль-
ные с тем или иным моногенным заболеванием с целью выявления
гетерозиготных носителей, либо непосредственно в популяциях,
где имеется большая выборка больных и можно предполагать
высокую частоту гетерозиготных носителей мутаций. При этом
выбор конкретных схем идентификации мутантных аллелей, за-
частую, определяется диагностическими возможностями лабора-
торий и стоимостью анализов. Особое внимание уделяют поиску
тех аллелей, которые встречаются в популяциях с высокой
частотой. Именно для таких мутаций разрабатывают более
простые и эффективные методы молекулярной диагностики, поз-
воляющие тестировать больных и проводить скрининг гетерози-
гот среди их родственников или среди определенных групп
населения.
Важнейшей характеристикой мутантного аллеля является
его корреляция с тяжестью течения заболевания, то есть фе-
нотипическое выражение мутации в гомозиготном и в гетерози-
готном состоянии, а также в компаунде с другими мутантными
аллелями того же гена. Для многих моногенных болезней обна-
ружено большое число аллелей, которые по своему клиническо-
му проявлению могут быть подразделены на различные группы,
от очень мягких, оказывающих незначительный повреждающий
эффект, до летальных или полулетальных, обусловливающих
смерть пациентов в раннем возрасте. Таким образом, молеку-
лярная диагностика мутаций может иметь определяющее значе-
ние для прогнозирования развития заболевания и выбора адек-
ватной тактики лечения. Подобные скринирующие программы в
настоящее время разработаны и успешно осуществляются во
многих странах для таких распространенных заболеваний как
серповидноклеточная анемия, муковисцидоз (Rene et
al.,1994). Реализация этих программ наряду с большой меди-
цинской пользой приносит и массу социальных проблем, неко-
торые из которых будут рассмотрены ниже.
ВВЕДЕНИЕ В МОЛЕКУЛЯРНУЮ ДИАГНОСТИКУ И ГЕНОТЕРАПИЮ
НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ.
В.Н.Горбунова, В.С.Баранов
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА I. СТРУКТУРА И МЕТОДЫ АНАЛИЗА ДНК.
Раздел 1.1 Общие представления, центральная догма, гене-
тический код.
Раздел 1.2 Выделение ДНК, ее синтез и рестрикция.
Раздел 1.3 Блот-гибридизация по Саузерну, гибридизация
in situ.
Раздел 1.4 ДНК-зонды, клонирование, векторные системы.
Раздел 1.5 Геномные и к-ДНК-овые библиотеки генов, их
скрининг.
Раздел 1.6 Секвенирование последовательностей ДНК.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57
|
