|
(уродствами) тех или иных тканей и органов. Метод заключает-
ся в возможности селективной элиминации тех специфических
типов клеток, которые отсутствуют или дефектны у больных с
моделируемым типом заболевания. Такие животные могут быть
получены при иньекции в зародыш рекомбинантной ДНК, содержа-
щей какой-либо цитотоксический ген, например, ген дифтерий-
ного токсина, находящийся под контролем работающих в опреде-
ленных типах клеток регуляторных элементов ДНК. При актива-
ции этих контролирующих элементов на определеной стадии раз-
вития экспрессия токсического гена приводит к избирательной
гибели всей специфической популяции клеток, то есть такая
система действует как очень точный скальпель.
Дальнейшая модификация метода заключается в использова-
нии для трансгеноза условно летального гена, каким является,
например, ген тимидинкиназы вируса Герпеса. Клетки,
экспрессирующие этот ген, функционируют совершенно нормаль-
но. Однако, на любой стадии онтогенетического развития можно
вызвать их селективную гибель при введении животному ганцик-
ловира - противогерпесного препарата. Эта система дает боль-
ше возможностей для экспериментального анализа роли специфи-
ческих клонов клеток в процессе нормального развития, а так-
же для изучения патологичеких процессов, связанных с гибелью
этих клеток. Подобная методология используется также при
разработке генотерапевтических подходов для лечения некото-
рых ненаследственных, в частности онкологических заболева-
ний (см Главу IX).
Весьма многообещающим методом моделирования представля-
ется направленное выключение работы определенных генов путем
введения в доимплантационные зародыши антисмысловых мРНК.
Такой подход был применен, в частности, при попытке модели-
рования болезни Гоше - лизосомного заболевания, обусловлен-
ного дефицитом бета-глюкуронидазы (Bevilacqua et al., 1988).
Естественно, что в этом случае выключение экспрессии гена
носит транзиторный характер, то есть моделью, по-сути, явля-
ется само животное - реципиент антисмысловой мРНК матрицы.
Другой пример экспериментального моделирования основан
на пересадке тканей или клеток атимусным иммунодефицитным
мышам nu/nu. У мышей этой линии в связи с отсутствием тимуса
и выраженным врожденным иммунодефицитом не происходит оттор-
жение трансплантированных чужеродных тканей. Более того, у
таких животных может происходить дифференцировка трансплан-
тированных подкожно эмбриональных зачатков и регенерация пе-
ресаженных кусочков тканей из различных органов других видов
животных и человека. Так например, кусочки трахеи крысы с
нанесенными на них клетками бронхогенного эпителия человека,
имплантированные подкожно атимусным мышам, формируют струк-
туру поверхностного эпителия, сходную с той, которая имеется
в бронхах человека. Именно таким путем мыши nu/nu были ак-
тивно использованы для анализа экспрессии мутантных вариан-
тов гена муковисцидоза человека, а также для испытания эф-
фективности коррекции этого генетического дефекта с помощью
методов генотерапии. В последнем случае мутантные эпители-
альные клетки пациентов с муковисцидозом вначале подвергали
трансфекции ретровирусными или аденовирусными векторами, не-
сущими, наряду с геном - репортером, полноразмерную кДНК
нормального гена муковисцидоза. Относительная простота по-
добных моделей и возможность генетического манипулирования с
клетками человека до их трансплантации атимусным мышам дела-
ют этот подход весьма привлекательным для решения многих
экспериментальных вопросов. Основные недостатки таких моде-
лей связаны с трудностями содержания и разведения атимусных
мышей и их низкой жизнеспособностью. Генетические линии жи-
вотных в этом отношении имеют значительные преимущества.
Раздел 8.4. Конструирование модельных генетических ли-
ний животных.
Современный уровень экспериментальной эмбриологии мле-
копитающих и современные достижения молекулярной генетики
позволяют осуществлять направленное получение генетических
моделей наследственных болезней путем введения сайт-специфи-
ческих модификаций в геном млекопитающих. Такой значительный
качественный прорыв в генетическом моделировании стал возмо-
жен благодаря появлению принципиально новой технологии мани-
пулирования с ранними зародышами млекопитающих. Особенно
важными в этом отношении оказались два новых методических
подхода: получение зародышей-химер, состоящих из клеточных
клонов разных зигот, путем введения тотипотентных клеток в
полость бластоцисты (Gardner, 1978) и разработка технологии
культивирования клеточных векторов, так называемых эмбрио-
нальных стволовых клеток (Evans, Kaufman, 1981). С другой
стороны, появились методы сайт-специфического переноса кло-
нированных последовательностей ДНК в геном эукариот, осно-
ванные на отборе клеточных клонов, в которых после трансфек-
ции происходит инсерция экзогенной ДНК в гомологичном сайте
геномной ДНК без какого-либо нарушения последовательности
ДНК в месте встраивания.
Конструированию генетических моделей должны предшество-
вать идентификация и сравнительный анализ двух гетерологич-
ных генов - гена человека, вследствие нарушения работы кото-
рого развивается моделируемое заболевание, и его гомолога у
выбранного для моделирования животного. При выборе обьекта
моделирования, в первую очередь, руководствуются методичес-
кими возможностями экспериментального манипулирования с жи-
вотными. Важное значение имеет сходство кодирующих областей
гетерологичных генов по нуклеотидным последовательностям. В
большинстве случаев мыши представляются наиболее удобным
обьектом для моделирования. Современный алгоритм формирова-
ния генетической линии животных с мутациями в заданном гене
предполагает: (1) наличие культур тотипотентных, то есть
способных к неограниченному развитию и дифференцировке, эмб-
риональных стволовых клеток; (2) создание на базе рекомби-
нантных ДНК генно-инженерных конструкций для направленного
переноса генов; (3) трансфекцию этих конструкций в культуры
эмбриональных стволовых клеток последующим скринингом и от-
бором клонов со специфическими генетическими модификациями;
(4) введение отобранных модифицированных клеток в зародыш на
стадии бластоцисты по методу Гарднера с целью получения хи-
мерных трансгенных животных; (5) отбор химерных особей, не-
сущих модифицированные гены в различных тканях и органах;
(6) селекцию особей, гетерозиготных по данной мутации; (7)
инбредное разведение и селекцию гомозигот (Рис.8.1).
Как упоминалось ранее, идеальной системой для направ-
ленного переноса мутаций в геном млекопитающих являются эмб-
риональные стволовые клетки - ЭСК (Evans, Kaufman, 1981;
Erickson, 1988; Labosky et al., 1994). Первичные культуры
этих клеток получают из клеток бластоцисты (внутренней кле-
точной массы) или из первичных половых клеток ранних пос-
тимплантационных зародышей. При выращивании на питательном
слое из эмбриональных фибробластов ЭСК сохраняются в недиф-
ференцированном состоянии от трех месяцев до года. При этом
они могут быть несколько раз заморожены и оттаяны без потери
способности к дифференцировке. ЭСК, введенные в бластоцель
(полость бластоцисты), сохраняют свою тотипотентность и мо-
гут участвовать в формировании, практически, всех эмбрио-
нальных зачатков и органов развивающегося зародыша. В ре-
зультате образуется животное - химера, состоящее из клеточ-
ных клонов двух разных типов: клеток исходного родительского
генотипа и ЭСК. Если эти клетки различаются, например, по
генам окраски шерсти, животное - химера будет иметь попереч-
ную или пятнистую окрашенность. При этом все животные, неза-
висимым образом полученные в результате введения в одинако-
вые по генотипу зародыши одной и той же линии клеток, будут
отличаться друг от друга по характеру пятнистости, так как
все химеры различны по набору клеточных клонов, развившихся
и дифференцировавшихся из введенных в зародыш ЭСК. Химерные
животные, у которых ЭСК дифференцировались в половые клетки
и дали начало полноценным зрелым гаметам будут устойчиво пе-
редавать своим потомкам генетическую информацию, содержащую-
ся в ЭСК. Таких животных ингда называют зародышевыми транс-
миттерами. При скрещивании их с мышами дикого типа часть по-
томков будет уже гетерозиготна по мутантным генам ЭСК, то
есть будут нести мутацию в гаплоидном состоянии в каждом ти-
пе клеток. Это в равной степени относится и к мутациям, ис-
кусственно введенным предварительно в ЭСК. Скрещивая таких
гетерозигот, можно получить животных, гомозиготных по задан-
ной мутации. Естественно, последнее достижимо только в том
случае, если мутация не окажется летальной в гомозиготном
состоянии у животных этого вида.
Возможность вести селекцию нужных мутантных или
трансгенных клонов ЭСК и лишь затем их использовать в ка-
честве клеточных векторов нашло широкое применение в генети-
ческом моделировании. Первоначально для этой цели ЭСК обра-
батывали различными мутагенами (этилнитрозомочевиной) отби-
рали клоны клеток, несущих мутацию в нужном гене, и затем
использовали их для создания инъекционных химер по Гарднеру.
Таким способом на мышах была получена модель болезни Леш-Ни-
хана - мутация гена гипоксантин-фосфорибозил-трансферазы
(Hooper et al.,1987). C разработкой технологии адресной
доставки чужеродной ДНК в гены-мишени этот способ генети-
ческого моделирования стал особенно эффективным. Сайт-специ-
фическая модификация генов ЭСК достигается за счет гомоло-
гичной рекомбинации между экзогенной и хромосомной ДНК. При
трансфекции большая часть проникших в ядра молекул рекомби-
нантной ДНК сохраняется там в течение двух-трех дней в виде
кольцевых эписом и в дальнейшем теряется либо происходит ин-
теграция трансфецирующей плазмиды в геном клетки- хозяина
путем негомологичной рекомбинации, то есть в случайные сайты
хромосомной ДНК. В таких клетках экспрессия введенных генов
устойчиво сохраняется. Частота интеграции экзогенной ДНК мо-
жет быть повышена при использовании линейных плазмид и спе-
циальных, преимущественно, ретровирусных векторов экзогенной
ДНК (см. Главу IX). Случаи стабильной интеграции экзогенной
ДНК могут быть легко выявлены, если трансфецирующие плазмиды
или вектора содержат селектируемый маркерный ген. Чаще всего
в качестве маркера используют прокариотический ген neo, со-
общающий клеткам устойчивость к неомицину. Клетки, в которых
произошла интеграции такой плазмиды в хромосомную ДНК, будут
образовывать устойчивые клоны при выращивании на среде G418,
содержащей неомицин, в то время как все другие клоны клеток
будут в этих условиях деградировать.
Раздел 8.5. Методы направленного переноса генов.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57
|
