|
экспериментальных подходов для идентификации и клонирования
генов линейных животных позволяют проводить параллельные
исследования, значительно ускоряющие эффективность поиска и
молекулярного анализа индивидуальных генов человека.
Для многих моногенных заболеваний человека животные,
несущие мутации в гомологичных генах, являются лучшими, а
зачастую и единственными моделями для исследования молеку-
лярных основ патогенеза и отработки оптимальных схем лече-
ния, в том числе и с применением методов генной терапии
(см.Главу IX). Поиск таких биологических моделей, прежде
всего, ведется, среди уже существующих генетических линий
животных с установленным типом наследования определенных
аномальных признаков. Наиболее трудным при этом является до-
казательство идентичности мутантных генов и, соответственно
первичных биохимических дефектов, у человека и у линейных
животных.
В различных питомниках мира, в том числе и в России,
созданы и поддерживаются кллекции, насчитывающие от десятков
до несколько сотен генетических линий различных эксперимен-
тальных животных - мышей, крыс, кроликов, собак и др. (Коню-
хов, 1969; 1980; Staat, 1969; Hogan et al, 1989; Бландова и
др., 1990). Среди них генетические линии мышей наиболее мно-
гочислены в первую очередь из-за высокой плодовитости,
удобства содержания, относительной легкости эксперименталь-
ного манипулирования и целого ряда других причин. Некоторые
из этих линий представляют собой случайные находки, другие,
а их большинство, получены в результате действия различных
мутагенных факторов. Так, значительное число биологических
моделей было получено путем биохимической селекции потомства
мышей самцов, обработанных сильными мутагенами - этилнитроз-
мочевиной, триэтиленмеламином или облученных Рентгеном. Так
были смоделированы на мышах альфа-талассемия, полицитемия,
почечный ацидоз (Erickson, 1988). Однако, такой способ полу-
чения животных-моделей, хотя и более эффективен, чем поиск
спонтанно мутировавших особей, также основан на чистой слу-
чайности и не позволяет направленно менять структуру нужного
гена.
Процесс создания подобных генетических линий обычно
включает отбор особей с фенотипическими отклонениями; анализ
наследования этих фенотипческих признаков; длительное близ-
кородственное разведение отселектированных особей. При моно-
генном наследовании такие линии могут либо целиком состоять
из мутантных гомозигот, либо поддерживаться через гетерози-
готных особей в случае сниженной жизнеспособности и наруше-
ния плодовитости у гомозигот.
На первом этапе поиска адекватной модели какого-либо
моногенного наследственного заболевания руководствуются
сходством клинических проявлений течения болезни и фенотипом
мутантных животных. Однако, одного этого сходства недоста-
точно (Конюхов, 1969). Необходимо доказать гомологичность
генотипической природы наблюдаемых нарушений, то есть дока-
зать, что у человека и у животных (мышей) фенотипические из-
менения обусловлены мутациями в гомологичных генах. Огромная
мировая генетическая коллекция мышей насчитывет несколько
сотен линий, в каждой из которых различные дефекты наследу-
ются по моногенному типу. Спонтанные биологические модели
наследственных болезней известны и достаточно полно изучены
для многих других экспериментальных и домашних животных.
Представляется удивительным, что, несмотря на большое
сходство геномов млекопитающих и наличие близких по первич-
ной структуре и тождественных по функциям структурных генов,
для значительной части наследственных болезней человека ге-
нетические аналоги среди животных до сих пор не найдены (Ко-
нюхов, 1969).
Это ограничение в настоящее время может быть преодалено
путем целенаправленного конструирования генетических модель-
ных линий животных. Экспериментальные основы такого подхода
уже хорошо разработаны (Erickson, 1988; Аллен и др., 1990;
Melton, 1993; Stewart et al., 1994). Для этого используют
технику культивирования и трансфекции эмбриональных стволо-
вых клеток (см.ниже), отбор in vitro клонов с нужными генет-
ческим изменениями и пересадку их в зародыши или в сомати-
ческие ткани животных. Для анализа экспрессии мутантных ге-
нов in vivo и оценки их биологического действия особенно
удобными оказались трансгенные животные.
Раздел 8.2. Трансгенные животные.
Трансгенных животных получают в результате искусствен-
ного введения - трансгеноза, чужеродного генетического мате-
риала, представляющего из себя фрагмент гена или иную после-
довательности ДНК, в оплодотворенную яйцеклетку или в ранние
зародыши млекопитающих. Подобные модели являются идеальными
экспериментальными системами для исследования молекуляр-
но-генетических основ онтогенеза, для изучения функции чуже-
родного гена, оценки его биологического действия на орга-
низм, а также для производства различных манипуляций со спе-
цифическими клеточными клонами in vivo. Разработано несколь-
ко способов получения трансгенных животных. Исторически бо-
лее ранним и широко применяемым до настоящего времени явля-
ется микроиньекция чужеродной ДНК в пронуклеус - ядро опло-
дотворенной яйцеклетки. Существуют детальные описания этого
метода (Аллен и др., 1990; Hogan et al, 1989). Суть метода
состоит в том, что под контролем микроскопа при помощи мик-
романипулятора в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцек-
летки тонкой иглой (до 1 микрона) вводят около 2 пиколитров
раствора ДНК. Чужеродная ДНК, вначале свободно лежащая в
нуклеоплазме, в течение нескольких последующих делений дроб-
ления случайным образом интегрирует в один из сайтов ка-
кой-либо хромосомы, то есть встраивается в ДНК-реципиента.
При этом, как показали эксперименты с меченой ДНК, в различ-
ных бластомерах одного и того же дробящегося зародыша интег-
рация может происходить в разные хромсомные сайты и число
интегрированных копий ДНК в каждом из этих сайтов может зна-
чительно варьировать. Тем не менее, поскольку сам эмбрион
развивается, по-сути, из одного бластомера, во всех клетках
такой особи после рождения чужеродная ДНК обычно находится
только в одном каком-нибудь хромосомном сайте, хотя у разных
особей она интегрируется по-разному и в разные сайты. После
введения чужеродной ДНК в пронуклеус яйцеклетку транспланти-
руют самке-реципиенту. Доля трансгенных животных в потомстве
таких самок варьирует от 10% до 30%. Это означает, что по-
добный механический вариант трансфекции чужеродных генов на
ранней стадии эмбриогенеза является чрезвычайно эффективным.
Идентификацию трансгенных животных производят путем анализа
геномной ДНК на наличие экзогенных последовательностей, ис-
пользуя при этом методы блот-гибридизации или ПЦР. Экспрес-
сию введенного гена анализируют путем идентификации специфи-
ческих мРНК и/или соответствующих белковых продуктов в раз-
личных тканях трансгенного животного.
Другой, более более прогрессивный способ получения
трансгенных животных основан на том, что трансфекции подвер-
гается не зигота, а тотипотентные эмбриональные стволовые
клетки (см.ниже), которые затем трансплантируют в полость
бластоцисты (Gardner, 1978). Этот метод и его решающие преи-
мущества в плане генетического моделирования подробно
рассмотрены в разделе 8.4.
Как правило, иньецированная ДНК при встраивании в хро-
мосому образует блок из множества тандемно расположенных ко-
пий, при этом число единиц повтора в блоке у разных
особей может варьировать от единицы до нескольких сотен.
После интеграции введенной ДНК в хромосому различные генети-
ческие конструкции устойчивы и стабильно передаются по-
томству в соответствии с законами Менделя. Встраивание вве-
денной ДНК в функционально значимые области генома может
приводить к их дестабилизации и сопровождаться появлением
мутаций, спектр которых очень разнообразен. Таким образом,
животные, полученные при введении одного и того же гена, бу-
дут различаться как по сайтам интеграции, так и по количест-
ву копий встроенной чужеродной ДНК, а в некоторых случаях,
по уровню мутабильности и по типам индуцированных мутаций.
Таким образом, каждое трансгенное животное в этом смысле
уникально.
Трансгенные животные являются черезвычайно удобным обь-
ектом для анализа роли отдельных элементов гена в регуляции
его работы. Так, сопоставление характера экспрессии введен-
ного гена у животных, различающихся по длине фланнкирующих
последовательностей иньецированной ДНК, дает возможность об-
наружить элементы гена, контролирующие его работу в разных
типах тканей. Для облегчения анализа регуляторных последова-
тельностей гена часто вводят генетические конструкции, соче-
тающие эти элементы с геном-репортером, экспрессия которого
выражается в появлении известной и легко определяемой фер-
ментативной активности. Использование для трансгеноза реком-
бинантных молекул ДНК, представляющих собой различные комби-
нации регуляторных элементов и кодирующих последовательнос-
тей, ведет к более глубокому пониманию молекулярных механиз-
мов активации генов в разных типах тканей.
Как уже указывалось, случайный характер интеграции чуже-
родной ДНК нередко индуцирует мутации и нарушает экспрессию
нормальных генов реципиента. В ряде случаев наблюдаемые отк-
лонения в развитии оказываются аналогичными или сходными с
уже известными наследственными нарушениями у человека и по-
добные животные также могут использоваться в качестве гене-
тических моделей заболеваний. Этот подход был применен для
получения моделей таких заболеваний, в патогенезе которых
решающую роль играет эффект дозы генов. В частности, путем
трансфекции зиготы мышей генами бета-глобина, коллагена, ре-
нина, антигенов гистосовместимости удалось получить биологи-
ческие модели таких заболеваний, как бета-талассемия, несо-
вершенный остеогенез, гипертония и диабет, соответственно
(Erickson, 1988). Во всех перечисленных случаях введение до-
полнительной дозы экспрессирующего гена приводило к наруше-
нию балланса белковых генопродуктов в клетках и, как следс-
твие этого, было причиной патологических процессов.
Раздел 8.3. Экспериментальное моделирование.
Другой вариант биологического моделирования основан на
получении животных с определенными очень специфичными, но
ненаследственными изменениями. Эти животные также могут быть
использованы для анализа молекулярных основ патогенеза и
разработки методов адекватного лечения. Рассмотрим несколько
примеров подобного экспериментального моделирования.
Описанная технология трансгеноза (введение генов в про-
нуклеус) может быть использована, в частности, для направ-
ленного получения животных с избирательными дефектами
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57
|
