|
к продуктам амплификации добавляют магнитные частицы с при-
шитым стрептавидином. Благодаря прочному связыванию биотин -
стрептовидин, меченая биотином последовательность ДНК фикси-
руется на магнитных частицах. С помощью щелочного лизиса с
частиц удаляют вторую немеченую комплементарную последова-
тельность ДНК, которую и используют для секвенирования. Еще
в одном варианте амплификацию проводят в присутствии прайме-
ров, несущих сайт узнавания для фермента Т7 - РНК полимера-
зы. После амплификации в системе in vitro проводят
транскрипцию амплификата с помощью Т7-РНК полимеразы и обра-
зовавшуюся одноцепочечную РНК используют для секвенирования
- метод GAWTS (genome amplification with transcript
sequences).
Однако, в общем случае секвенирование полноразмерной
кДНК или всех экзонов для генотипирования мутаций у отдель-
ных пациентов достаточно трудоемко, дорого и требует много
времени. Поэтому на практике чаще проводят предварительный
отбор более простыми методами амплифицированных, а иногда
клонированных фрагментов ДНК, предположительно содержащих
мутации, а затем секвенируют только эти участки ДНК. Методы
поиска фрагментов ДНК, предположительно содержащих мутации,
основаны на сравнительном анализе мутантных и нормальных
последовательностей по целому ряду физических и химических
характеристик, которые в значительной степени варьируют в
зависимости от типа мутационного повреждения. Следует под-
черкнуть, что независимо от метода детекции мутации и прак-
тически независимо от её природы (замены нуклеотидов, деле-
ции, дупликации и пр.) точные молекулярные характеристики
каждой мутации могут быть получены только путем прямого сек-
венирования. При наличии в амплифицированном фрагменте из-
вестных сайтов рестрикции положение мутации может быть пред-
варительно уточнено. Для этого продукты амплификации разре-
зают соответствующей эндонуклеазой и исследуют более корот-
кие фрагменты.
Наиболее просто обнаруживаются мутации, изменяющие дли-
ну амплифицированных фрагментов, так как подобные нарушения
легко выявляются при электрофоретическом анализе. Так, про-
тяженные делеции, захватывающие целые экзоны, могут быть вы-
явлены по изменению длины рестрикционных фрагментов, гибри-
дизующихся со специфическими ДНК-зондами. Более простая и
эффективная методика выявления таких мутаций в генах, сцеп-
ленных с полом, основана на одновременной амплификации раз-
личных экзонов, наиболее часто вовлекаемых в подобные пе-
рестройки, так называемый мультиплексный вариант ПЦР. Разни-
ца в размерах и числе амплифицированных фрагментов позволяет
легко идентифицировать такие мутации на электрофорезе
(Рис.4.2). Особенно широко этот метод используется для иден-
тификации делеций в гене дистрофина, на долю которых прихо-
дится около 60% всех мутаций, приводящих к миодистрофии Дю-
шенна (см.Главу X). При отсутствии делеций все амплифициро-
ванные фрагменты после электрофоретического разделения и ок-
рашивания можно наблюдать в виде отдельных полос. Если в
исследуемой ДНК какие-то из экзонов делетированы, будут
отсутствовать и соответствующие им полосы на электрофорег-
рамме (Рис.4. 2). Выбирая специфические участки гена для ам-
плификации, можно оценить размер делеции с точностью до от-
дельных экзонов, а также определить ее внутригенную локали-
зацию.
Метод этот, однако, не обнаруживает подобные делеции,
находящиеся в гетерозиготном состоянии или локализованные в
аутосомных генах, так как нормальная гомологичная последова-
тельность геномной ДНК может служить матрицей для амплифика-
ции любых фрагментов. Данный подход применим к анализу деле-
ций в аутосомных генах только в тех случаях, когда возможно
дополнить ПЦР количественной оценкой результатов амплифика-
ции - так называемая количественная ПЦР. Оригинальный метод
идентификации подобных делеций у гетерозигот основан на
использовании в качестве матричной ДНК для ПЦР кДНК, полу-
ченной путем обратной транскрипции из эктопической мРНК или
из мРНК, изолированной из экспрессирующих данный ген тканей
или культур клеток пациента. В отличие от нормального гомо-
лога, в мутантной молекуле кДНК граничащие с делецией экзоны
сближены. Если в качестве олигопраймеров для ПЦР будут выб-
раны последовательности из этих областей гена, только му-
тантная кДНК будет служить матрицей для амплификации неболь-
шого участка между праймерами из фланкирующих делецию экзо-
нов. В нормальной последовательности кДНК этот участок может
быть слишком велик, для того чтобы прошла амплификация.
Практически, для обнаружения гетерозигот по протяженным
внутригенным делециям проводят мультиплексную ПЦР с исполь-
зованием системы олигопраймеров, обеспечивающих амплификацию
фрагментов, полностью перекрывающих всю молекулу кДНК. Нали-
чие делеции регистрируют по появлению продуктов амплификации
необычного размера.
Небольшие делеции и вставки нуклеотидов не приводят к
отсутствию амплифицированных фрагментов ДНК, но изменяют их
размеры. Эти изменения могут быть зарегистрированы при
электрофорезе продуктов амплификации в полиакриламидном или
агарозном гелях (Рис.4.3). Именно этот метод используется
для детекции наиболее часто встречающейся мутации в гене му-
ковисцидоза - делеции трех нуклеотидов ^F508. После выявле-
ния различий между нормальной и мутантной ДНК по длине рест-
рикционных или амплифицированых фрагментов гена необходимо
провести секвенирование необычного фрагмента, с целью опре-
деления изменений в первичной структуре мутантной ДНК после-
довательности по сравнению с нормальной.
При мутациях гена, представляющих собой замену одного
или нескольких нуклеотидов, длины амплифицированных фрагмен-
тов остаются постоянными, однако, некоторые физико-хими-
ческие свойства мутантных молекул ДНК меняются. Так, напри-
мер, при гибридизации однонитевых ДНК, комплементарных нор-
мальной и мутантной нитям ДНК, возникают структурные наруше-
ния в месте негомологичного спаривания. С учетом этих осо-
бенностей разработаны различные варианты поиска мутантных
фрагментов ДНК и идентификации в них точечных мутаций. Веду-
щими из этих методов являются: метод анализа конформационно-
го полиморфизма однонитевой ДНК - SSCP, денатурирующий гра-
диентный гель-электрофорез - DGGE, метод химического расщеп-
ления некомплементарных сайтов (CMC), метод гетеродуплексно-
го анализа (HA) и, наконец, собственно метод секвенирования
Основные характеристики этих методов приведены в Табл.4.3
Таблица 4.3. Преимущества и недостатки основных методов пер-
вичной идентификации мутаций.
-------T---------T--------T------------T----------------¬
¦метод ¦ размер ¦ %% ¦ точность ¦ сканирование ¦
¦ ¦фрагмента¦детекции¦картирования+---------T------+
¦ ¦ (п.о.) ¦мутаций ¦ мутации ¦ экзонов ¦ кДНК ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+------+---------+--------+------------+---------+------+
¦SSCP ¦ 250 ¦ 80% ¦ нет ¦ +++ ¦ + ¦
¦DGGE ¦ 600 ¦ 95% ¦ нет ¦ ++ ¦ ++ ¦
¦СМС ¦ 1700 ¦>95% ¦ да ¦ + ¦ +++ ¦
¦PCR DS¦ 500 ¦>99% ¦ да ¦ ++ ¦ ++ ¦
¦НА ¦ 300 ¦ 80% ¦ нет ¦ ++ ¦ + ¦
L------+---------+--------+------------+---------+-------
"+" - применимость метода для сканирования геномной ДНК и
кДНК
SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) - метод
анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК, пред-
ложенный (Оrita et al.1989, Сlavac, Dean, 1993) основан на
регистрации различий в электрофоретической подвижности одно-
нитевых ДНК, одинаковых по величине, но различающихся
вследствие нуклеотидных замен по пространственной организа-
ции молекул (Рис 4.4). Скручивание или конформация небольших
однонитевых ДНК существенно зависит от их нуклеотидной
последовательности, так что замена даже одного основания в
молекулах одинакового размера приводит к изменению их прост-
ранственной структуры. Метод включает амплификацию специфи-
ческих сегментов ДНК размером от 50 до 300 пар оснований,
обычно в присутствии меченых трифосфатов, денатурацию обра-
зовавшихся продуктов ПЦР и нативный высокоразрешающий элек-
рофорез в полиакриламидном геле. Иногда амплификацию прово-
дят без использования метки, но тогда для лучшего разделения
ДНК и однозначной идентификации бэндов на электрофореграмме
используют специальные гели - Hydrolink либо MDE (AT
Biochem,USA), а также более чувствительные по сравнению с
этидиумом бромидом методы окрашивания, такие как окраска се-
ребром. На процесс конформации оказывают влияние различные
внешние факторы - температура, концентрация акриламида и
глицерина в геле, ионная сила буферных растворов
(Сlavac,Dean,1993). Оптимальный подбор этих параметров поз-
воляет эффективно разделять амплифицированные фрагменты ДНК,
различающиеся даже всего на один нуклеотид. Конформационный
метод выявления точечных мутаций быстро получил широкое
распространение благодаря своей простоте и возможности обна-
руживать любые типы замен. Эффективность детекции мутаций
при размерах амплифицируемого фрагмента менее 200 п.о.
составляет 70-95%, но при длине фрагмента, превышающей 400
п.о., вероятность обнаружения мутаций уменьшается до 50%.
DGGE (Denaturation Gradient Gel Electrophoresis) - ме-
тод денатурирующего градиентного гель-электрофореза, основан
на зависимости свойств плавления (или денатурации) небольших
двухнитевых молекул ДНК от их нуклеотидной последователь-
ности, а точнее от соотношения A-T и G-C пар в исследуемых
фрагментах (Майерс и др.,1990; Fodde, Losekoot, 1994). Объ-
ясняется это тем, что G-C связь более прочная по сравнению
со связью между нуклеотидами A и T. Подобные различия в ди-
намике плавления могут быть выявлены путем сравнения подвиж-
ности нормальных и мутантных двухнитевых фрагментов ДНК при
их электрофорезе в денатурирующих условиях ( Рис.4.5). Гра-
диент денатурации достигается разницей температур, различной
концентрации мочевины или формальдегида в гелях. При этих
условиях одинаковые по величине двухнитевые молекулы ДНК,
отличающиеся по нуклеотидной последовательности, денатуриру-
ют по -разному . Разработан компьютерный алгоритм, позволяю-
щий предсказывать характер плавления в зависимости от нукле-
отидной последовательности (Lerman, Silverstein, 1987). При
электрофорезе амплифицированных двухнитевых фрагментов ДНК в
геле с линейно возрастающим градиентом концентраций денату-
рирующих агентов плавление нитей ДНК происходит в строго
специфичной для данной последовательности области, эквива-
лентной температуре плавления - tm, то есть такой температу-
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57
|
