|
новятся "бессмертными", то есть могут неограниченно долго
поддерживаться в условиях культивирования. CEPH-семьи
представляют собой идеальные системы для генетического ана-
лиза наследственных признаков. В результате исследования
этих клеточных линий определены генотипы членов CEPH-семей
одновременно по тысячам полиморфных локусов и построены
соответствующие генетические карты. Кроме того, совместными
усилиями многих лабораторий мира были созданы Банки Клеточ-
ных Культур, в которых поддерживаются коллекции лимфоб-
ластозных линий клеток, полученных от членов наиболее инфор-
мативных семей, в которых наблюдается сегрегация по различ-
ным наследственным признакам, в том числе по моногенным за-
болеваниям. Материал этих линий в виде клеточных клонов или
образцов ДНК используется, в частности, для анализа сцепле-
ния сегрегирующих генов с известными генетическими маркерами
или с вновь описанными полиморфными локусами. Таким образом,
во многих случаях при картировании генов человека удается
преодолеть ограничения, связанные с недостатком обширных ин-
формативных родословных.
Наконец, в начале 70-х годов появилась реальная возмож-
ность точной идентификации не только всех хромосом в карио-
типе человека, но и их отдельных сегментов. Это связанно с
появлением методов дифференциального окрашивания препаратов
метафазных хромосом, которые, по сути, произвели революцию в
цитогенетике и хромосомологии. Для получения дифференциаль-
ной окраски хромосомные препараты окрашивают некоторыми флю-
орохромами, либо, после соответствующей протеолитической об-
работки или нагревания, - красителем Гимза. При этом на хро-
мосомах выявляется характерная поперечная исчерченность, так
называемые бэнды, расположение которых специфично для каждой
хромосомы. На метафазных хромосомах малой степени спирализа-
ции идентифицируется около 750 таких полос, на прометафазных
хромосомах 2 500 - 3 000. Следовательно, величина небольших
бэндов на прометафазных хромосомах примерно соответствует 1
сМ на цитогенетических картах или 1 миллиону пар оснований
на физических картах. Такие ориентировочные рассчеты, как
уже упоминалось, оказываются полезными при сопоставлении
масштабов различных генетических карт.
Согласно официально утвержденной номенклатуре
(ISCN,1971) каждая хромосома человека после дифференциальной
окраски может быть разделена на сегменты, нумерация которых
начинается от центромерного района вверх (короткое плечо -
р), либо вниз (длинное плечо - q) (Рис.3.4). Полосы в каждом
сегменте также пронумерованы в аналогичном порядке. Крупные
полосы зачастую подразделяются на несколько частей, соот-
ветствующих более мелким бэндам, выявляемым только при ок-
раске малоспирализованных прометафазных хромосом. Запись по-
ложения гена на цитогенетической карте включает номер хро-
мосомы, плечо, а также номер сегмента, бэнда и его субъеди-
ницы. Например, запись 7q21.1 означает, что ген локализован
в субъединице 1, 1-го бэнда 2-го сегмента длинного плеча
хромосомы 7.
Такая подробная запись особенно удобна при использова-
нии для цитогенетического картирования метода гибридизации
in situ (см.Главу I), позволяющего локализовать ген с точ-
ностью до одного бэнда и даже его субъединицы. Основу данно-
го метода, как уже указывалось составляет гибридизация ге-
номной ДНК целых хромосом на разных стадиях их спирализации
с предварительно меченными специфическими ДНК-зондами.
Источником последних могут служить геномные последователь-
ности ДНК, сцепленные с картируемым геном, либо кДНК-овые
последовательности. В настоящее время из тканеспецифических
библиотек генов выделено около 20 000 анонимных последова-
тельностей кДНК, представляющих более 10 000 различных генов
человека (Sikela, Auffray, 1993). Эти кДНК составляют при-
мерно 10-15% всех кодирующих последовательностей генома. Ме-
тодом гибридизации in situ уже идентифицировано более 2000
генов, для многих из которых пока не найдено сцепление с по-
лиморфными маркерами (Poduslo et al., 1991). Такие кодирую-
щие последовательности присутствуют на карте генов человека,
но их пока нет на картах сцепления.
Раздел 3.3 Генетические индексные маркеры.
Как мы уже отмечали раньше, успешная локализация неиз-
вестного наследственного признака (гена) в значительной сте-
пени определяется присутствием на карте фланкирующих марке-
ров, находящихся на относительно небольшом расстоянии по обе
стороны от гена. В качестве генетических маркеров специфи-
ческих участков хромосом могут быть использованы любые лока-
лизованные в этих участках элементы генома с высоким уровнем
легко идентифицируемой популяционной изменчивости или поли-
морфизма. Отбор сцепленных с картируемым признаком генети-
ческих маркеров производят по результатам совместного анали-
за их сегрегации в информативных семьях.
Значительные успехи в геномном картировании были связа-
ны с использованием в качестве генетических маркеров широко
распространенной во многих популяциях изменчивости по изо-
ферментному спектру различных белков. Оказалось, что многие
ферменты у разных индивидуумов, в разных тканях и на разных
стадиях онтогенеза могут находиться в различных изоформах.
Такие варианты одного и того же белка обычно не отличаются
по специфической активности, но имеют измененную электрофо-
ретическую подвижность. Популяционный анализ изоферментов
обнаружил существование полиморфизма для очень многих белко-
вых систем, контролируемых разными генами, локализованными
во многих хромосомах. Таким образом, для этих хромосом были
найдены генетические маркеры, с помощью которых были иденти-
фицированы соответствующие группы сцепления.
Совершенствование молекулярных методов анализа специфи-
ческих последовательностей ДНК привело к обнаружению большо-
го числа высокоизменчивых участков генома - полиморфных сай-
тов рестрикции, гипервариабельных мини- и микросателлитных
последовательностей (см.Главу II) Эта изменчивость также бы-
ла использована для маркировки участков хромосом с целью
установления более точного взаиморасположения локусов. Вско-
ре после обнаружения полиморфных сайтов рестрикции были
опубликованы теоретические рассчеты, согласно которым от 10
до 20 таких локусов, расположенных равномерно на каждой хро-
мосоме на расстоянии около 20 сМ друг от друга, достаточно
для определения хромосомной принадлежности генов, от-
ветственных за любой тип наследственной изменчивости
(Botstein et al,1980). По этим оценкам около 200 таких ин-
дексных маркеров позволят построить карты сцепления для всех
известных генов на основании анализа сегрегации соответству-
ющих признаков в семьях с большим числом мутантов. Для опре-
деления порядка расположения генов на хромосомах и оценки
генетических расстояний между ними достаточно около 400 рав-
номерно распределенных полиморфных маркеров.
Идентификация в геноме человека большого числа поли-
морфных сайтов рестрикции и разработка простых методов ана-
лиза индивидуальной изменчивости по этим локусам существенно
повысили возможности локализации неизвестных признаков на
геномных картах. Уже к 1989г. были картированы более 2000
клонированных последовательностей ДНК, обнаруживающих поли-
морфизм по длине рестрикционных фрагментов (ПДРФ) в различ-
ных популяциях (Kidd et al., 1989). Более 1000 из них типи-
ровано в CEPH-коллекциях родословных. В значительной степени
это анонимные последовательности, связь которых со специфи-
ческими генами не установлена. Их наименования чаще всего
соответствуют названию отобранного из библиотеки генов кло-
на. В дальнейшем была разработана стандартная генетическая
номенклатура для обозначения используемых в качестве марке-
ров сегментов ДНК с неизвестной функцией. Первая буква D,
что значит ДНК, затем номер хромосомы, далее S для уникаль-
ных и Z для повторяющихся последовательностей и в конце но-
мер, идентифицирующий данный зонд в определенном районе ДНК.
Применение полиморфных сайтов рестрикции в качестве ге-
нетических маркеров имеет два ограничения: сравнительно низ-
кая информативность (частота гетерозигот не может превышает
50%- см. Главы II, Y) и неравномерное распределение
ПДРФ-сайтов по хромосомам. Этих недостатков практически ли-
шены гипервариабельные STR-сайты (ди-, три- и тетрануклеа-
тидные повторы). Использование микро- и минисателлитных ДНК
последовательностей в качестве индексных генетических марке-
ров открыло новую эру в построении карт сцепления генома че-
ловека. В настоящее время работа по идентификации высокопо-
лиморфных маркеров, перекрывающих весь геном и равномерно
распределенных по хромосомам практически завершенаа
(Weissenbach et al.,1992; Reed et al.,1994). Эта система
построена на базе динуклеотидных (C-A)n повторов.
(C-A)n*(G-T)n представляют собой наиболее частый класс
простых повторов, обнаруженных в геноме человека (за исклю-
чением An* Tn мультимеров). Такие повторы присутствуют при-
мерно в 1% колоний из геномных библиотек, сконструированных
на базе фрагментов длиной 300 - 500 п.о., которые образуются
после переваривания геномной ДНК эндонуклеазой Alu1. Более
90% из них оказываются полиморфными по числу копий в класте-
ре, причем в 70% локусов присутствует более трех аллелей. В
1992г. группе французских ученых под руководством Жана
Вайссенбаха удалось разработать систему идентификации с по-
мощью ПЦР индивидуальной изменчивости в местах локализации
(C-A)n повторов и на этой основе создать геномную карту из
814 высокополиморфных индексных маркеров со средним расстоя-
нием между ними около 5 сМ, получившую название
Genethon-коллекции микросателлитных маркеров (Weissenbach et
al., 1992). Для этого были просеквенированы более 12 000
фрагментов ДНК, выделенных из геномной Alu1-библиотеки путем
ее скрининга poly(dC-dA)*poly (dG-dT) ДНК-зондом. Праймеры
для амплификации подбирали из последовательностей ДНК, окру-
жающих повторы, используя для этого компьютерные программы.
Для дальнейшего анализа было отобрано около 3 000
(C-A)n-сайтов и проведена специфическая амплификация этих
участков у четырех неродственных CEPH-индивидуумов. На сле-
дующем этапе была определена хромосомная принадлежность по-
лутара тысяч наиболее информативных маркеров путем их иден-
тификации в панели из 18 соматических гибридных клонов, со-
держащих разные наборы хромосом человека. Детальная карта
сцепления индексных маркеров построена по результатам их ге-
нотипирования в коллекции 8 самых больших CEPH-родословных.
Предложенная система маркеров перекрывает все хромосомы, а
суммарное расстояние между ними соответствует примерно 90%
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57
|
