ре, при которой каждая пара оснований с 50%-ой вероятностью

может соединиться или разойтись. После начала плавления

продвижение двухнитевого фрагмента ДНК в геле резко замедля-

ется вследствие сложной пространственной конфигурации моле-

кул, причем эта задержка будет длиться до тех пор, пока не

наступит полная денатурация ДНК. В результате происходит

разделение фрагментов ДНК, различающихся по нуклеотидному

составу. Таким способом удается идентифицировать лишь около

50% однонуклеотидных замен в фрагментах ДНК длиной от 50 до

нескольких сотен нуклеотидов. Связано это с тем, что при

прохождении ДНК через гель может начаться частичная денату-

рация концов молекул еще до достижения оптимальной области

плавления. Поэтому мутации, локализованные вблизи концов ам-

плифицированных участков ДНК, оказывают меньшее влияние на

процесс плавления и поэтому могут не выявляться. Эффектив-

ность обнаружения мутаций с помощью градиентного денатуриру-

ющего электрофореза может быть существенно повышена за счет

присоединения к концам амплифицированной геномной ДНК синте-

тических фрагментов GC-нуклеотидов, длиной в несколько

десятков пар оснований. Такие монотонные тугоплавкие концы

выполняют роль своеобразных зажимов и резко увеличивают

шансы обнаружения для всех точечных мутаций, независимо от

их локализации внутри исследуемого фрагмента ДНК. Эта моди-

фикация делает метод очень чувствительным (см.Таб.4.2). В

отличии от SSCP он пригоден для более крупных амплифициро-

ванных фрагментов ДНК. При исследовании фрагментов до 600

п.о. эффективность выявления мутаций этим методом достигает

95%. Чаще всего DGGE -метод применяется для скрининга мута-

ций в амплифицированных экзонах, при этом в качестве матрицы

используют геномную ДНК. Этот метод может быть с успехом

применен также для анализа индуцированных мутаций, так как

позволяет улавливать точечные мутации, возникшие даже в од-

ной из 100 обработанных мутагеном клеток. К недостаткам ме-

тода следует отнести техническую сложность получения равно-

мерного градиента денатурирующего агента в полиакриламидном

геле, а также высокую стоимость искусственно синтезированных

GC-концов.

HA (Неteroduplex analysis) - гетеродуплексный анализ поз-

воляет идентифицировать мутации, находящиеся в компаунде или

в гетерозиготном состоянии. Следует заметить, что у подавля-

ющего большинства пациентов с генными болезнями, наследуемы-

ми по аутосомно-рецессивному типу, мутации в гомологичных

хромосомах находятся в компаунде, то есть в каждом из гомо-

логичных генов имеются функционально значимые нарушения, но

их молекулярная природа и внутригенная локализация различны.

Исключение составляют лишь мажорные мутации, частота которых

в популяции достигает десятков процентов. Примерами таких

мутаций являются ^F508 в гене муковисцидоза или R408W мута-

ция в гене фенилкетонурии. Принцип HA-метода заключается в

том, что при амплификации относительно небольших фрагментов

генов гетерозигот или гомозиготных компаундов мутация может

быть локализована лишь в одной из гомологичных нитей матрич-

ной ДНК. Поэтому в амплификационной смеси наряду с двумя ти-

пами гомодуплексов образуются гетеродуплексы между нормаль-

ной и мутантной цепочками ДНК. Такие гетеродуплексные моле-

кулы ДНК имеют иную электрофоретичеcкую подвижность по срав-

нению с гомодуплексами (не отличающимися между собой по под-

вижности) за счет конформационных особенностей в местах

несовпадения нуклеотидов (mismatch) (Рис.4.6). Эти различия

могут быть обнаружены при электрофорезе в обычном полиакри-

ламидном геле. Значительно более эффективное разделение гомо-

и гетеродуплексов может быть достигнуто при использовании

новых вариантов гелей - Hydrolink либо MDE. Вероятность

идентификации точечных мутаций этим способом на фрагментах

ДНК менее 300 п.о. достигает 80-90%. Детекция мутаций осу-

ществляется как изотопным, так и неизотопными методами

(Grompe, 1993).

CMC (Chemical Mismatch Cleavage) - метод химического

расщепления некомплементарных сайтов, основан на способности

некоторых химических агентов специфически разрывать нить ДНК

в месте локализации неспаренного основания (Рис.4.7). Так,

цитозин чувствителен к действию гидроксиламина, а тимин - к

действию тетроксида осмия. Некоторые модификации метода

используют чувствительность тимина и гуанина к карбодиимиду.

Последующая обработка пиперидином приводит к полному разрыву

молекулы ДНК в модифицированном сайте. Выявление мутаций

осуществляют с помощью меченых ДНК-зондов, соответствующих,

как правило, нормальным вариантам последовательности ДНК.

Такими зондами могут быть синтезированные олигонуклеотиды,

клонированные последовательности ДНК или амплифицированные

фрагменты (Cotton, 1990; Cotton, Malcolm, 1991).

При проведении исследования эталонную меченую ДНК сме-

шивают с избытком тестируемой ДНК (или РНК). Тестируемыми

образцами ДНК могут служить клонированные ДНК, обработанные

соответствующими эндонуклеазами, либо амплифицированные

фрагменты. Смесь нагревают до полной денатурации двухнитевых

молекул и затем охлаждают, чтобы создать условия для образо-

вания дуплексов. При наличии мутаций в тестируемых образцах

ДНК в гетеродуплексах, возникших в результате гибридизации

между однонитевыми молекулами эталонной и тестируемой ДНК,

образуются места негомологичного спаривания. После обработки

соответствующими химическими агентами идентификация и лока-

лизация мутантных сайтов в исследуемых участках ДНК прово-

дится путем электрофореза и авторадиографии. Появление уко-

роченных фрагментов ДНК на электрофореграмме (а точнее нео-

бычных бэндов в нижней части геля) свидетельствует о наличии

мутантного сайта, а определение размера укороченных фрагмен-

тов однозначно определяет локализацию этого сайта в исходной

тестируемой молекуле ДНК. Современные модификации метода

CMC позволяют идентифицировать до 95-100% мутаций

(Grompe,1993). Большими преимуществами этого метода являются:

(1) возможность исследовать протяженные участки ДНК - до 2

кб, (2) способность одновременно выявить и локализовать

несколько мутаций в одном фрагменте ДНК и (3) возможность

одновременно использовать несколько ДНК-зондов для поиска

мутаций - мультиплексный вариант методики. К числу недостат-

ков можно отнести высокую токсичность используемых хими-

ческих реактивов. Последняя может быть частично ослаблена

использованием карбодиимида для идентификации GT гетеродуп-

лексов.

Весьма близким по принципу к CMC- методу является метод

расщепления гетеродуплексов РНКазой А. С этой целью созда-

ются условия для образования гетеродуплексов между тестируе-

мой ДНК и комплементарной ей радиоактивно меченой РНК про-

бой. При обработке РНКазой А происходит разрезание молекул

РНК в местах нарушения спаривания оснований. Места точечных

мутаций определяются как и в случае СМС, по размерам образо-

вавшихся фрагментов после электрофореза и авторадиграфии.

Необходимость использования радиоактивно меченой РНК- пробы

и возможность детекции только около 50% точечных мутаций ли-

митируют широкое применение метода (Grompe, 1993).

Первичная идентификация мутаций может быть осуществлена

путем анализа нарушений не в нуклеотидной последовательности

гена, а в аминокислотной последовательности соответствующего

полипептидного продукта. Для этого выделяют тотальную мРНК

из лейкоцитов крови, проводят обратную транскрипцию, ампли-

фицировуют специфические экзоны кДНК (метод RT-PCR), встраи-

вают амплифицированную область ДНК в экспрессионную систему

и анализируют образовавшийся продукт. Этот метод особенно

эффективен при детекции мутаций в протяженных генах, содер-

жащих большое число экзонов, таких как ген миопатии Дюшенна

или ген нейрофиброматоза 1.

Раздел 4.6. Молекулярное сканирование известных мутаций.

Рассмотренные выше методы обнаружения мутаций предпола-

гают обязательное секвенирование содержащих их сегментов ДНК

с целью точной идентификации нуклеотидных нарушений, оценки

их фенотипического проявления и определения причастности к

развитию болезни. Поэтому они редко используются в практи-

ческой диагностике и при популяционном скрининге гетерози-

гот. После описания мутации появляется возможность ее анали-

за более простыми способами, не требующими секвенирования.

Как упоминалось выше, мутации, изменяющие длину амплифициро-

ванных фрагментов, могут быть выявлены с помощью нативного

электрофореза в полиакриламидном или агарозном гелях.

Из миссенс мутаций наиболее просто диагностируются те

замены нуклеотидов, которые приводят к исчезновению или об-

разованию сайта узнавания для какой-нибудь из рестриктаз.

Они выявляются по изменению длины амплифицированного фраг-

мента ДНК после его обработки соответствующей эндонуклеазой.

Поэтому сразу после идентификации мутации проводится компь-

ютерный поиск возможных сайтов рестрикции в месте локализа-

ции замены основания. Вероятность такого события довольно

велика, так как для каждой из нескольких сотен известных в

настоящее время рестрикционных эндонуклеаз сайтом узнавания

служит своя специфическая последовательность ДНК, средние

размеры которой составляют 5 - 6 нуклеотидов.

Если естественных рестрикционных сайтов в месте мутации

найти не удается, то такие сайты могут быть созданы

искусственно. В частности, разработана методика создания с

помощью ПЦР новых сайтов рестрикции в мутантных аллелях, но

не в аллелях дикого типа - метод ПЦР-опосредованного

сайт-направленного мутагенеза ( Ng et al., 1991; Eiken et

al.,1991). Для этого амплифицируемый участок ДНК выбирают

таким образом, чтобы 3'-конец одного из праймеров непосред-

ственно примыкал к мутантному сайту (Рис.4.8). Именно этот

праймер неполностью комплементарен матричной ДНК. В нем из-

меняют один из нуклеотидов с 3'-конца так, чтобы в сочетании

с нуклеотидом мутантного, но не нормального сайта в этом

месте образовывался сайт рестрикции для какой-нибудь из эн-

донуклеаз. Тогда после рестрикции и электрофореза продуктов

амплификации геномной ДНК у индивидуумов, не содержащих дан-

ную мутацию, на электрофореграмме будет присутствовать один

нерестрицированный фрагмент, у гетерозигот появится два до-

полнительных фрагмента, соответствующих по длине рестрициро-

ванным сегментам ДНК, и у гомозигот по мутации будут

присутствовать только эти два фрагмента.

Концептуально близким к этому варианту является метод

получивший название "амплификация рефрактерной мутационной

системы"- amplification refractory mutation system - ARMS. В

основе метода лежит неспособность Taq1 термофильной полиме-

разы к амплификации фрагмента при наличии несоответствия

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57