|
других медико-генетических центрах России.
Итак, предлагаемая монография рассчитана на достаточно
широкий круг читателей, но, прежде всего, на медиков и биоло-
гов, а также специалистов смежных профессий. Нам хотелось бы
думать, что книга будет особенно полезной для студентов меди-
цинских институтов и академий, врачей курсов повышения квали-
фикации, сотрудников медико-генетических консультаций и цент-
ров, а также для студетнов-биологов, многие из которых, как
показывает наш опыт, пополняют ряды специализированных диаг-
ностических лабораторий, медико-генетических центров и инсти-
тутов.
ГЛАВА III
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ КАРТЫ, ПОЗИЦИОННОЕ КЛОНИРОВАНИЕ.
Раздел 3.1 Классификация генетических карт, оценка
сцепления.
Генетические карты определяют хромосомную принадлеж-
ность и взаимное расположение различных компонентов генома
относительно друг друга. Возможность построения таких карт
обусловлена двумя фундаментальными характеристиками генома:
линейным характером локализации генов в хромосомах (это оп-
ределяется линейностью молекулы ДНК) и относительной ста-
бильностью расположения облигатных элементов генома в преде-
лах вида. При построении генетических карт используют разные
подходы. В первую очередь, к ним относятся анализ генети-
ческого сцепления на основе определения частот мейотической
рекомбинации в информативных семьях и изучение особенностей
наследования признаков, сцепленных с маркерными хромосомными
перестройками. Во-вторых, исследование экспрессии генов или
поиск специфических последовательностей ДНК в клеточных гиб-
ридах, содержащих лишь часть генома человека - одну или
несколько хромосом или их фрагменты. В ряде случаев с этой
целью используют механический сортинг целых хромосом и даже
их относительно небольших участковв. Эти приемы позволяют
привязать картируемый ген к определенной хромосоме и даже к
определенному фрагменту хромосомы. С помощью комплекса весь-
ма тонких методов хромосомного анализа, прежде всего, мето-
дов гибридизации in situ (см. Главу I) удается картировать
отдельные гены на хромосомах человека часто с точностью до
одного бэнда. И, наконец, методами молекулярного анализа
осуществляют физическое картирование последовательностей
ДНК, локализованных в специфических участках хромосом. Затем
проводят идентификацию в этих последовательностях транскри-
бируемых областей, то есть генов, с последующей изоляцией и
клонированием соответствующих им полноразмерных молекул
кДНК. Каждый из рассмотренных этапов анализа структуры гено-
ма завершается построением карт генов, различающихся по еди-
ницам измерения расстояний между отдельными элементами этих
карт, масштабам, по насыщенности или степени детализации на
различных участках генома. Соответственно различают карты
сцепления, генетические карты, цитогенетические карты инди-
видуальных хромосом и физические или молекулярные карты оп-
ределенных участков ДНК. Для полной молекулярной идентифика-
ции отдельных элементов генома, то есть определения их гра-
ниц, структуры и нуклеотидной последовательности, необходимо
совмещение всех типов карт в местах локализации этих элемен-
тов.
Первым шагом на пути построения генетических карт явля-
ется формирование групп сцепления генов, контролирующих
различные наследственные признаки, и исследование их взаим-
ного расположения в этих группах. На следующем этапе опре-
деляют соответствие между генетическими группами сцепления
и цитогенетически идентифицируемыми хромосомами или их
фрагментами. Цитогенетическую идентификацию хромосом прово-
дят с использованием методов дифференциальной окраски
(см.раздел 3.2). По мере появления все большего числа лока-
лизованных признаков эффективность построения генетических
карт значительно возрастает, так как увеличивается число
маркированных участков хромосом и, таким образом, появля-
ется возможность комбинированного использования различных
экспериментальных подходов для более подробного исследова-
ния этих участков.
Принципиальная схема картирования неизвестных генов,
представленная на Рис.3.1, включает следующие этапы. 1. Вы-
яснение группы сцепления; 2. Поиск ближайших фланкирующих
маркеров; 3. Определение физической области (ДНК-последова-
тельности), включающей искомый ген; 4. Клонирование набора
фрагментов ДНК, перекрывающих исследуемую область; 5. Выде-
ление из этого набора клонов, содержащих транскрибируемые
ДНК-последовательности, предположительно соответствующие
гену или его фрагменту; 6. Анализ специфических мРНК и кло-
нирование кДНК-последовательности; 7. Секвенирование и
идентификация самого гена (Wicking, Williamson, 1991).
Рассмотрим подробнее эту схему.
Построение карт сцепления основано на изучении про-
цессов расхождения и рекомбинации гомологичных хромосом в
мейозе. Генетические признаки, локализованные в разных хро-
мосомах, не сцеплены друг с другом, то есть передаются от
родителей детям независимо, и частота их рекомбинации (Q)
составляет 0.5. Это обусловлено случайным характером
расхождения гомологичных хромосом в мейозе во время редук-
ционного деления. Гены, локализованные в одной хромосоме,
рекомбинируют за счет кроссинговера, то есть за счет обмена
участками гомологичных хромосом в процессе их спаривания в
мейозе (Рис.3.2). При этом порядок генов не нарушается, но
в потомстве могут появиться новые комбинации родительских
аллелей. Вероятность кроссинговера между двумя генами за-
висит от расстояния между ними. Чем ближе гены расположены
друг к другу, то есть чем больше они сцеплены, тем эта ве-
роятность меньше.
Оценку сцепления между генами проводят на основании
статистического анализа сегрегации признаков в семьях с
разветвленными родословными. Чаще всего при этом используют
метод максимального правдоподобия (Kao, 1983), то есть
подсчитывают десятичный логарифм шансов - lod (log of the
odds), где шансы (odds) выражаются как отношение вероят-
ности наблюдаемой родословной при условии, что два гена
сцеплены (0 < Q < 0.5), к той же вероятности при отсутствии
сцепления (Q = 0.5). Если значение lod > +3, гены локализо-
ваны в одной хромосоме, причем максимально правдоподобная
оценка соответствует максимальному значению lod. При значе-
ниях lod < -2 гены не сцеплены, то есть локализованы в раз-
ных хромосомах или на разных концах одной хромосомы. Ста-
тистическую обработку родословных обычно проводят с помощью
компьютерных программ, наиболее известные из которых прог-
раммы LIPED, CRIMAP и LINKAGE (Ott, 1985; Ott, 1991;
Terwilliger, Ott, 1994). На генетических картах сцепления
расстояние между генами определяется в сантиморганах (сМ).
1 сМ соответствует 1% рекомбинации. Общая длина генома че-
ловека в этих единицах составляет около 3300 сМ. Сопостав-
ляя эту величину с размером гаплоидного набора молекул ДНК,
можно заключить, что 1 сМ приблизительно эквивалентен 1
миллиону пар нуклеотидов. Такие расчеты, однако, весьма
приблизительны, так как частоты рекомбинации, а значит и
реальная длина одного сМ, могут сильно варьировать в раз-
личных частях генома. Существуют, так называемые, горячие
точки рекомбинации, также как и районы генома, где рекомби-
нация подавлена (центромерные и теломерные участки хро-
мосом, блоки конститутивного гетерохроматина и др.). Из-
вестно также, что частота рекомбинации у мужчин меньше, чем
у женщин, так что общая длина мужского генома, измеренная в
единицах рекомбинации, составляет лишь 3000 сМ. Таким обра-
зом, генетическое расстояние может дать лишь весьма ориен-
тировочную информацию о физическом (реальном) расстоянии,
выражаемом в парах нуклеотидов.
Раздел 3.2 Соматическая гибридизация, цитогенетический
анализ, картирование анонимных последова-
тельностей ДНК.
До начала 70-ых годов построение генетических карт че-
ловека продвигалось очень медленными темпами. Небольшой раз-
мер семей, длительный период одного поколения, ограниченное
число информативных родословных и отсутствие методов эффек-
тивного цитогенетического анализа всех пар хромосом затруд-
няло целенаправленное картирование генов человека. Достаточ-
но сказать, что 1-й ген человека - ген цветной слепоты был
картирован на Х-хромосоме в 1911г., а 1-й аутосомный ген-
только в 1968г. К 1973г. на хромосомах человека было карти-
ровано всего 64 гена, а к 1994 на генетических картах чело-
века было локализовано уже свыше 60 000 маркерных ДНК
последовательностей, в том числе около 5 000 структурных
генов - Рис.3.3. Столь стремительный прогресс в картирова-
нии генов человека связан с появлением новых технологий в
цитогенетике, в клеточных культурах и особенно в молекуляр-
ной генетике.
Техника соматической гибридизации, то есть возможность
экспериментального конструирования способных к размножению
межвидовых клеточных гибридов, явилась одним из наиболее
мощных инструментов для нахождения связей между группами
сцепления и цитогенетически идентифицируемыми хромосомами и
даже их отдельными сегментами. Гибридные клоны получают пу-
тем искусственного слияния культивируемых соматических кле-
ток разных видов, в частности, клеток человека и различных
грызунов - китайского хомячка, мыши, крысы (Шея,1985).
Культивирование таких соматических гибридов, как оказалось,
сопровождается утратой хромосом человека. Так были получены
панели гибридных клеточных клонов, содержащих всего одну
или несколько хромосом человека и полный набор хромосом
другого вида. Обнаружение человеческих белков, специфи-
ческих мРНК или последовательностей ДНК в таких клонах поз-
воляет однозначно определить хромосомную принадлежность
соответствующих генов. Таким способом удалось локализовать
более 250 аутосомных генов человека (Kao, 1983).
Дальнейший прогресс в области генетического картирова-
ния в значительной степени ассоциируется с деятельностью
многих научно-исследовательских центров и лабораторий по
созданию банков клеточных культур, представляющих наиболее
интересные и обширные родословные. Так, в Центре по Изучению
Полиморфизма Человека (CEPH) (Париж, Франция) была создана
уникальная коллекция перевиваемых клеточных культур от всех
членов семей, многоступенчатые родословные которых насчиты-
вают многие десятки и даже сотни индивидуумов (CEPH-семьи)
(Todd,1992; Weissenbach et al,1992). Перевиваемые линии кле-
ток получали из первичных культур, трансфорированных вирусом
Эпштейн-Барра, после чего такие лимфобластозные клетки ста-
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57
|
