определять и учитывать иммунный статус до первой выпойки молозива

и после его скармливания;

. абсорбция колостральных иммуноглобулинов находится в прямой

зависимости от ряда факторов важнейшими из которых являются:

способность новорожденных телят усваивать их из молозива, условия

внешней среды, качество молозива и своевременная выпойка первого

молозива в адекватном количестве;

. лактоглобулин совместно с ретинолом отличаются высоким иммуно-

корректирующим эффектом и широтой профилактического действия;

. аминазин совместно с Т-активином обладают иммуно-корректирующим

действием и антисекреторной активностью ингибирующей

трансформацию аденозинтрифосфата (АТФ) в циклический 3,5-

аденозинмонофосфат (АМФ).

РАЗДЕЛ 2

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Материалы и методы исследований.

2.1.1.Общая методика. Экспериментальная часть работы выполнялась на

ферме крупного рогатого скота учебно-опытного хозяйства «Кетросу», района

Анений Ной, ОПХ «Колоница» района Криулень и в лаборатории микробиологии

кафедры эпизоотологии Государственного aграрного университета Молдовы с

1973 по 1998 год.

Опыты проводились на коровах черно-пестрой породы 5-8 лактации и на

родившихся от них телят, с целью изучения состояния неспецифической и

специфической иммунологической реактивности новорожденных телят при

колибактериозе, а также выявления роли кислотно-основного баланса в течение

инфекционного процесса, коррекции иммунодефицитного состояния новорожденных

телят. Для лечения применяли антисекреторные препараты, ингибирующие

циклический аденозинмонофосфат.

Пробы молозива отбирались в первый день (из первого, второго и третьего

доения), на второй, пятый день после отела, а на десятый, двадцатый день и

через месяц исследовалось молоко.

В сыворотке крови, молозиве и молоке изучались: динамика накопления

агглютининов, иммуноглобулиновый уровень, в т. ч. в динамике.

Сыворотку крови получали путем отстаивания, а из молозива — методом

пепсинизации. Из сывороток молозива первого и второго дня после отела

выделяли колостральную сыворотку и лактоглобулин. У родившихся телят от

опытных и контрольных групп коров в сыворотке крови изучали: динамику

накопления О- и К- антител-агглютининов, уровень иммуноглобулинов в

зависимости от клинического статуса, показатели фагоцитоза, пропердина,

комплиментарной и бактерицидной активности (до поения молозивом, на 2, 5,

10, 20 и 30 день жизни).

Бактерицидные свойства колостральной сыворотки и сыворотки крови

новорожденных телят изучали нефелометрическим методом. Профилактические и

лечебные свойства молозивных сывороток и лактоглобулина изучались на

лабораторных животных и телятах.

Коррекцию иммунодефицита неонатальных телят, проводили с применением

лактоглобулина и витамина А.

В качестве анти-секреторных факторов, ингибирующих циклический

аденозинмонофосфат (сАМР) применяли хлорпромазин и Т-активин.

Опыты проводились на 562 телятах, 468 коровах, 247 белых мышах и 30

кроликах.

Полученный цифровой материал подвергался биометрической обработке по

различным биометрическим методикам: [Дж. У. Снедекор, 1961; И. П. Ашмарин,

А. А. Воробьев, 1962; В. Ю. Урбах, 1964; Е. В. Гублер, А. А. Генкин А. А.,

1969].

2.1.2. Приготовление колибактериозного антигена. Для приготовления

антигена использовали три серотипа колибактерий: О78:К80, О119:К69 и

О137:К79.

Использованные серотипы Е. coli по морфологическим и биохимическим

свойствам были типичными, отвечающими требуемым иммуногенным, антигенным н

вирулентным свойствам.

Е. coli О78:К80, О119:К69 и О137:К79 раздельно высевали в пробирки с

мясопептонным бульоном на 12 ч и проверяли на чистоту (микроскопия мазков,

окрашенных по Граму). В последующем бульонную культуру высевали на

стерильный мясопептонный агар в матрацах. Посевы выращивали в термостате в

течение 18 ч при температуре 37° С, проверяли на чистоту и смывали

стерильным изотоническим раствором хлорида натрия. Для выделения О-антигена

бактериальную суспензию автоклавировали при 120°С в течение 2 ч дня

разрушения К-антигена. Густую отмытую суспензию Е. coli содержащую 10 млрд.

микробных тел в 1 мл по оптическому стандарту, смешивали с ацетоном в

отношении 1:5 до появления коагуляции (свертывания). Плотную часть

материала отбирали на воронке Бюхнера, промытой один раз ацетоном и затем

высушенной эфиром. Препарат высушивали на воздухе и хранили при 4°С.

Сухой порошок применяли для приготовления суспензии антигена, добавляя 1

мг высушенных ацетоном бактерий на 1 мл барбиталового буфера.

Для выделения К-антигена бактериальную суспензию получали путем смыва из

агаровых культур изотоническим раствором хлорида натрия, содержащего 0,5 %

формальдегида. Бактерии были экстрагированы при добавлении ацетона

непосредственно после их смыва с агаровой культуры и промыты. [E. Neter, E.

A. Gorzynski, R. M. Gino, O. Westphal and O. Luderwitz. 1956; E. Neter,

1957].

Полученные О- и К-антигены проверяли на стерильность и на безвредность.

Стерильность устанавливали путем высева на МПБ, МППБ и МПА. Посевы

выдерживали 10 дней в термостате (+37°С). Безвредность антигенов была

проверена на лабораторных животных. Для этого каждый из антигенов вводили

10 белым мышам под кожу в области спины по 0,5 мл и 5 морским свинкам в

области внутренней поверхности задней конечности по 1,0 мл. Клинические

наблюдения за опытными животными вели в течение 15 дней.

Отсутствие роста в посевах на МПБ, МППБ и МПА и гибели привитых животных

позвонило считать антигены стерильными и безвредными. Хранились антигены

при температуре +4 +5°С в холодильнике.

2.1.3. Изучение агглютиногенных свойств серотипов О78:К80, О119:К69 и

О137:К79 Е. coli. Для определения агглютиногенности изучаемых серотипов

использовали 30 кроликов, по 5 на каждый серотип (определение О- и К-

антигенов). Антигены вводили кроликам в краевую вену уха в нарастающих

дозах (от 0,5 до 2,0 мл) с интервалом в три дня, четырехкратно.

Для определения О-антигена смешивали одну каплю антигена с одной каплей

соответствующей О-сыворотки на зеркальном стекле, размещали над водяной

баней при 60°С. Результаты учитывали через 10 мин после смешивания.

Позитивную реакцию подтверждали пробирочной агглютинацией, применяя

формалинизировавную шестичасовую культуру в МПБ. Основное разведение

сыворотки 1:10.

Для определения К-антигена культуру вначале тестировали пластинчатой

реакцией агглютинации на предметном стекле. Одну каплю живой суспензии

культуры смешивали с одной каплей различных антисывороток. Результаты

учитывали в течение 30с после смешивания. Позитивную реакцию подтверждали

пробирочной агглютинацией до титра тест сыворотки, применяя как антиген

живую пятичасовую культуру в МПБ. Пробирки инкубировали при 37°С два часа,

в последующем агглютинационные пробирки центрифугировали при 2000 об/мин в

течение трех минут. Одинаковый писк агглютинации учитывали как позитивную

реакцию. [E. Neter, E. A. Gorzynski, R. M. Gino, O. Westphal and O.

Luderwitz. 1956; E. Neter, 1957].

2.1.4. Получение сыворотки крови, молозива и молока. Кровь от животных

(коров, телят) брали из яремной вены в стерильные пробирки и помещали в

термостат (+37°С) на 3 ч, после чего выдерживали 12-16 ч при комнатной

температуре до полного отделения сыворотки. Затем сыворотку отсасывали в

стерильные пробирки и помещали в холодильник (+4 +5°С).

Молозиво от коров брали при первом, втором и третьем доении после отела,

а затем на второй, пятый, десятый, двадцатый дни и через месяц.

Сыворотку из молозива и молока получали путем добавления пепсина. На

каждые 1000 мл молозива или молока добавляли 100 мл 0,5% раствора пепсина и

после тщательного перемешивания смесь помещали в водяную баню при

температуре 38° С на четыре часа. Образовавшийся сгусток, отделяли от

сыворотки фильтрацией через три слоя марли. Полученную сыворотку пропускам

через воронку Бюхнера с двойным слоем бедой фильтровальной бумаги, а затем

через бактериальный фильтр Зейтца.

2.1.5. Реакция атглютинации с молозивной и молочной сыворотками. В

центрифужные пробирки наливали 5-6 капель 5 % раствора пепсина,

приготовленного на изотоническом растворе хлорида натрия и 10 мл

исследуемого молозива или молока, тщательно перемешивали и для свертывания

ставили в термостат при температуре 38°С на 30 мин. Свернувшееся молозиво

отделяли от стенок пробирки стеклянной палочкой и центрифугировали при 3000

об/мин в течение 30 мин.

С полученной сывороткой ставили реакцию агглютинации в объеме 1 мл в

разведениях с физиологическим раствором от 1:10 до предельного титра

сыворотки. Контроли обычные.

Антиген добавляли по 0,05 мл в каждую пробирку, пробы встряхивали и

помешали в термостат при температуре 37°С на 4 ч, после чего производили

предварительный учет реакции, а окончательный учет реакции определяли через

24 ч. Молозиво исследовали в день его получения.

2.1.6. Определение титра агглютининов. Для изучения динамики накопления

агглютининов в сыворотках крови и молозива использовали реакцию

агглютинации, которую ставили в объеме 1 мл (классическим методом) в

пробирках с ровным округлым дном с убитыми и живыми О- и К-антигенами

(серотипы О78:К80; О119:К69; О137:К79 Е. coli ).

Для определения агглютинационных титров, в наших исследованиях применяли

двукратное разведение сывороток. Разведение сывороток крови и молозива

производили в агглютинационных пробирках начиная с разведения 1:10.

После добавления антигена (по 0,05 мл) содержимое пробирок встряхивали,

затем помещали в термостат на 4 ч при температуре 37°С. После этого

производили предварительный учет результатов реакции. В дальнейшем пробирки

выдерживали 24 ч при комнатной температуре и определяли окончательный

результат.

Для учета результатов реакции агглютинации пользовались четырех

крестовой системой обозначения. За агглютинационный титр принимали то

наибольшее разведение сывороток, при котором еще наблюдалась видимая

агглютинация, оцениваемая в четыре креста.

2.1.7. Определение активности лизоцима в сыворотке крови. Сыворотку

крови, отделяли общепринятым методом. Предварительно готовили 1/15М

фосфатный буфер (рН 6,2), для чего использовали два исходных раствора:

4,539 г х. ч. КН2РО4 растворенный в 500 мл дистиллированной воды и 2,375 г

х. ч. Nа2НРО4Ч12Н2O, растворенный в 200 мл дистиллированной воды. При

смешивании этих растворов в определенном соотношении, получали рН буфера

6,2.

Для приготовления 1 % агара «Дифко» на 1/15М фосфатном буфере брали 1 г

сухого агара, помещали в колбу на 200 мл и заливали 99 мл 1/15М фосфатного

буфера. Колбу закрывали ватно-марлевой пробкой, помещали в кипящую баню и

выдерживали 25-30 мин.

Расплавленный агар охлаждали до 60-70°С и вносили в него ацетоновый

порошок Micrococcus lysodeikticus из расчета 10-20 мг на 100 мл объема.

Необходимое количество порошка перед внесением в агар суспендировали в 3-5

мл 1/15М фосфатного буфера. Полученную смесь перемешивали до получения

однородной взвеси.

Полученную смесь разливали в чашки Петри с таким расчетом, чтобы

подучить толщину слоя 4 мм.

После застывания агара в нем при помощи тонкостенной трубочки вырезали

лунки диаметром 5 мм на расстоянии 2-3 см от краев чашки и друг от друга.

Для подсыхания лунок чашки помещали в термостат приоткрытыми на 60 мин.

Исследуемые пробы сыворотки крови разводили соответственно 1/15М фосфатным

буфером 1:10, 1:2 и 1:5. Каждую пробу после разведения заливали в отдельную

лунку в объеме 0,05 мл.

Параллельно с исследуемым материалом 1/15М фосфатным буфером разводили

стандартный кристаллический лизоцим так, чтобы получить его растворы с

концентрацией 0,5 мкг/мл, 1; 3; 5; 10; 20; 40; 60; 80 и 100 мкг/мл. По 0,05

каждого разведения стандартного лизоцима разливали по отдельным лункам.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16