|
Чашки Петри с исследуемым материалом и стандартным лизоцимом выдерживали
48 ч во влажной камере при комнатной температуре (22-24°С).
После экспозиции при помощи линейки измеряли диаметр зон лизиса
Micrococcus lysodeikticus вокруг лунок с исследуемым материалом и
стандартным лизоцимом.
Первоначально на полулогарифмической бумаге строили калибровочную
кривую, используя результаты, полученные при измерении зон лизиса вокруг
лунок с раствором стандартного лизоцима в различных концентрациях. Для
этого значения, отражающих диаметры зон лизиса субстрата в миллиметрах,
откладывали по оси абсцисс, а показатели концентрации стандартного лизоцима
в мкг/мл, вызывающих лизис по оси ординат. Точки пересечения первых и
вторых значений соединяли между собой, при этом получалась прямая линия.
Расчет результатов проводили следующим образом. Диаметр зоны лизиса
Micrococcus lysodeikticus вокруг лунки с сывороткой крови составил 9,5 мм.
На калибровочном графике этому значению соответствовала концентрация 2,5
мкг/мл стандартного лизоцима. Сыворотку крови перед исследованием разводили
1:10 1/15М фосфатным буфером. Следовательно, концентрация лизоцима в
исследуемой пробе сыворотки крови равнялась 2,5Ч10=25 мкг/мл. Так как,
литическая активность стандартного лизоцима изменяется в результате
изготовления и хранения, полученное абсолютное значение выражали в единицах
относительной активности. Активность стандартного лизоцима составляла 20600
ед/мг или 20,6 ед/мк, активность лизоцима исследуемой пробы сыворотки
молозива равнялась 20,6Ч25 =515,0 ед/мл.
2.1.8. Определение содержания комплемента в сыворотке крови.
Исследовали сыворотку крови, полученную из яремной вены животных.
Предварительно готовили веронал-мединаловый буфер: 0,575 г веронала
растворяли в 50 мл дистиллированной воды, подогретой до 60° С, охлаждали и
добавляли 8,5 г хлорида натрия, 0,375 г мединала, 0,5 мл раствора
содержащего 1 М MgCl2 и 0,3 М CaCl2 (100 мл Н2О + 19 г MgCl2Ч6Н2О г + 6 г
CaCl2). Объем доводили до 200 мл дистиллированной водой. Буфер хранили в
холодильнике. Перед употреблением буфер разводили дистиллированной водой
(1:4). Физиологический раствор: 8,5 г хлорида натрия растворяли в 1 л
дистиллированной воды и фильтровали.
Эритроциты барана. Кровь у барана брали из яремной вены в колбу с бусами
и встряхивали в течение 10-15 мин для предотвращения свертывания.
Дефибринированную кровь фильтровали через двойной слой марли. Эритроциты
барана отмывали 3 раза центрифугированием по 10 мин при 3000 об/мин. Из
отмытых эритроцитов готовили 5 % взвесь на физиологическом растворе и
стандартизовали на ФЭК. С этой целью эритроциты лизировали: к 1 мл отмытых
эритроцитов добавляли 9 мл дистиллированной воды. Лизированные эритроциты
фотоколориметрировали при зеленом светофильтре против воды. Оптическая
плотность лизата — 1,08 при длине 541 мкм в кювете 10 мм.
Для определения титра гемолизина, готовили вначале основное разведение
гемолитической сыворотки 1:100 (0,1 мл сыворотки + 9,9 мл буфера), затем из
этого разведения поучали разведения от 1:1000 до 1:4000.
| |1:1000 |1:1200 |1:1500 |1:2000 |1:2500 |1:3000 |1:3500 |1:4000 |
|Буфер, мл |0,9 |1,1 |1. 4 |1,9 |2,4 |2,9 |3,4 |3,9 |
|Гемолизин |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |
Гемолитическую систему готовили следующим образом. К стандартизованной 5
% взвеси эритроцитов барана медленно, при постоянном помешивании, добавляли
равный объем гемолизина в тройном титре. Так, если полный гемолиз
наблюдался в пробирке с разведением гемолитической сыворотки 1:1200, то для
приготовления гемолитической системы брали разведение 1:400 (0,1 мл цельной
гемолитической сыворотки и 39,9 мл буфера). Пробирки с гемолитической
системой встряхивали и инкубировали при 37° С в течение 1ч для
сенсибилизации эритроцитов барана.
Исследуемую сыворотку, разводили 1:10, разливали в 10 пробирок и
доводили буферным раствором (физиологическим) до 1,0 мл. После этого в
каждую пробирку добавляли 1 мл гемолитической системы, то есть
сенсибилизированных эритроцитов барана, 2-я пробирка — контрольная.
|Исследуемая сыворотка|0,05|0,1 |0,15|0,2 |0,25|0,3 |0,35|0,4 |0,45|0,5 |
|(1:10), мл | | | | | | | | | | |
|Буферный раствор |0,95|0,9 |0,85|0,8 |0,75|0,7 |0,65|0,6 |0,55|0,5 |
|Сенсибилизированные |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |1,0 |
|эритроциты барана | | | | | | | | | | |
Пробирки инкубировали при 37° С в течение 45 мин, охлаждали в
холодильнике 10 мин, центрифугировали при 1500 об/мин и колориметрировали
на ФЭК в кюветах (10мм) с зеленым светофильтром против воды и определяли
процент гемолиза.
Для определения активности комплимента в гемолитических единицах
готовили шкалу и кривую гемолиза. Для приготовления шкалы гемолиза к 1 мл
стандартной 5 % взвеси эритроцитов барана прибавляли 3 мл дистиллированной
воды в результате чего происходил гипотонический лизис эритроцитов (100 %
гемолиз). Пробирку центрифугировали (при 1500 об/мин 10 мин) и готовили
шкалу гемолиза:
|100 % гемолиз эритроцитов|0,1 |0,2 |0,3 |0,4 |0,5 |0,6 |0,7 |0,8 |0,9 |1,0 |
|на дистиллированной воде | | | | | | | | | | |
|Буферный раствор, мл |0,9 |0,8 |0,7 |0,6 |0,5 |0,4 |0,3 |0,2 |0,1 |0 |
|Гемолиз, % |10 |20 |30 |40 |50 |60 |70 |80 |90 |100 |
Полученные разведения и исходный раствор колориметрировали на ФЭК в
кюветах (1 мм) и строили график зависимости коэффициентов экстинции от
процента гемолиза. На оси абсцисс откладывали процент гемолиза, на оси
ординат — показатели экстинции, соответствующие данному проценту гемолиза.
Расчет 50 % гемолитических единиц комплемента в 1 мл проводили следующим
образом. После титрования исследуемой сыворотки, инкубации ее при 37° С в
течение 45 мин, выдержки в течение 10 мин в холодильнике при 4° С и
центрифугирования пробирку из шкалы гемолиза с одной 50 % единицей
комплемента (№5) сравнивали с пробирками из ряда титрования сыворотки. Если
содержимое пробирки №5 соответствовало по цвету пробирке №6, из ряда
титрования комплемента исследуемой сывороткой, то есть дозе комплемента 0,3
мл, то расчет вели следующим образом.
0,3 мл сыворотки (разведение 1:10) соответствует одной 50 %
гемолитической единице комплемента, а в 1 мл исследуемой сыворотки
содержится:
0,3 мл (1:10) — 1
1,0 мл — Х
Х =[pic] = 3,33 ел/мл.
2.1.9. Определение содержания пропердина в сыворотке крови. Для
определения титра пропердина исследуемую сыворотку разводили мединал-
вероналовым буфером (рН 7,2-7,4), начиная с 1:10 до 1:320. В центрифужные
пробирки вносили по 0,2 мл каждого разведения сыворотки, до 0,2 мл
суспензии инулина (соответствует 3 мг сухого вещества) и по 0,2 мл
комплемента в рабочем титре. В контрольный ряд пробирок вместо инулина
добавляли по 0,2 мл буфера. Все пробы (опытные и контрольные) помещали на 1
ч в термостат при 37° С, после чего центрифугировали, переносили
супернатант в отдельные пробирки по 0,3 мл и добавляли по 0,2 мл
стандартной гемолитической системы. Реакцию учитывали после 20-минутной
экспозиции при 37° С. За титр пропердина принимали то наибольшее разведение
сыворотки, в котором наблюдается полная задержка гемолиза, и в каком
разведении в контрольном ряду отличается полный гемолиз. Данные
рассчитывали по формуле:
|Разведение, в котором отмечен|— |Разведение, в котором отмечена |Ч10 |
|полный гемолиз в контроле | |полная задержка гемолиза в опыте| |
|Разведение, в котором отмечен полный гемолиз в контроле |
Полученные результаты выражали в ед/мл. При полной задержки гемолиза в
разведении 1:35 в опыте, а в контроле — полный гемолиз в разведении 1:50,
содержание пропердина в 1 мл испытуемой сыворотки составляет:
[pic]Ч10 = 3 ед/мл.
Тестированные показатели: комплементарную, лизоцимную, пропердиновую
активность, а также содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови, молоке и
молозиве крупного рогатого скота определяли по методам В. Г. Дорофейчук,
1968; X. Я. Грант, Л. И. Яворский, И. А. Блумберг, 1973; И. М.
Архангельский, 1976; В. Н. Андреев, Г. И. Подопригора, 1977; Е. С.
Фортинская, А. М. Наумова, Е. А. Маркова, 1977; О. Н. Грызлова, П. А.
Емельяненко, В. Н. Денисенко, 1978; Э. Бем, 1979; П. А. Емельяненко, О. И.
Грызлова, Г. Н. Печникова и М. Н. Тулупова, 1980; Э. С. Коган, 1981; Г. В.
Павлов, Г. Н. Печникова, Смолянская- О. О. Суворова, 1988; В. В.
Биктимиров, 1993.
При определении лизоцима, учитывая замедленную активность фермента
крупного рогатого скота, приводили тщательную подготовку материалов к
исследованию, чтобы избежать ошибок, связанные с действием на тест-микробы
других литических факторов исследуемой пробы.
При тестировании комплементарной активности сыворотки крови тщательно
осуществляли подбор индикаторной системы чувствительной к комплементу
крупного рогатого скота.
Для определения пропердина использовали модифицированный метод
предложенный П. А. Емельяненко и др., 1980.
2.1.10. Изучение бактерицидной активности сывороток крови. Для
определения бактериостатической и бактерицидной активности сывороток крови
О. В. Смирнова, Т. А. Кузьмина (1966) предложили фотонефелометрический
метод.
В нашей работе мы учитывали изменения оптической плотности питательной
среды с микробами и питательной среды с испытуемой сывороткой крови и
микробами сразу после соединения и через 3-, 5-, 7-, 9-, 12- и 24-часовой
инкубации.
Для нефелометрического метода чистую культуру Е. coli высевали на МПА и
выращивали в термостате при температуре 37° С в течение 24 ч. Затем смывали
стерильным изотоническим раствором хлористого натрия и стандартизовали до
содержания в 1 мл 2 млрд. микробных тел. Из этой взвеси производили посев
на МПБ в пробирки и сутки выращивали в термостате при вышеуказанной
температуре.
Для определения бактерицидной активности сывороток крови мы использовали
питательную среду (обогащенный пептоном бульон Хоттингера), содержащую 200
мг% амминного азота.
В стерильные кюветы с рабочей длиной 10 мм стерильной пипеткой разливали
по 4,5 мл бульона Хоттингера, затем добавляли по 0,5 мл испытуемой
сыворотки крови и суточную бульонную культуру Е. coli по одной
бактериологической петле (диаметр петли 4 мм).
Контрольные кюветы заполняли теми же компонентами, что и опытные с той
лишь разницей, что в один кювет вместо сыворотки добавили 0,5 мл
стерильного изотонического раствора хлорида натрия. Содержимое всех кювет
тщательно перемешивали стерильной стеклянной палочкой, после чего все
кюветы закрывали ватно-марлевыми пробками. Оптическую плотность среды
определяли на фотоэлектроколориметре ФЭК-М, используя зеленый светофильтр.
После этого кюветы ставили в термостат при температуре 37° С. Повторно
определяли оптическую плотность содержимого кювет через 3, 5, 7, 9, 12 и 24
ч. Установку «0» на ФЭК-е производили с помощью кюветы, заполненной
дистиллированной водой. Оценку бактерицидной активности сыворотки крови
проводили по формуле:
А=100- [pic]Ч100,
Где: А — бактерицидная активность (в %);
Д — оптическая плотность;
Т — время экспозиции кювет в термостате (в часах).
Затем вычисляли среднюю «напряженность бактерицидной активности» (НБА)
по формуле:
Средняя НБА = [pic],
Где: НБА — средняя напряженность бактерицидной активности молозивной
сыворотки;
А1, А2, А3.....Аn — бактерицидная активность сыворотки молозива через 3,
5, 7, 9, 12 и 24ч (в %);
Т1, Т2, Т3....... Тn — продолжительность термостатирования (в часах).
2.1.11. Постановка опсонофагоцитарной реакции. При постановке
опсонофагоцитарной реакции руководствовались методикой, описанной В. Я.
Мозгис (1982). Для приготовления антигена культуру Е. coli выдерживали в
термостате при температуре 37° С в течение 18-24 ч в МПБ, а затем на МПА в
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16
|
