Если при конструировании новой системы на основе ТФИФА невозможно или

нежелательно использование коммерческих универсальных конъюгатов

(антивидовых фермент-меченных антител), то встает вопрос о синтезе

конъюгата на основе выбранных фермента и антител. Как уже указывалось,

наиболее специфичные и высокоактивные конъюгаты могут быть получены на

основе только максимально очищенных белковых ингредиентов. Однако в связи с

относительной сложностью и трудоемкостью работ по тщательной очистке

бактериальных и вирусных антигенов в настоящее время при разработке

иммуноферментных систем часто используются либо цельные сыворотки, либо

суммарные фракции иммуноглобулинов, содержащие в своем составе как

специфические, так и балластные антитела. Антигены также часто не

подвергаются надлежащей очистке и используемый при конструировании

диагностикума белок составляет лишь небольшой процент от суммарного белка.

В связи с этим резко повышается вероятность неспецифических реакций,

особенно опасных при высокой чувствительности, которой обладают ИФ-

методики.

Большое значение для успешного использования ТФИФА в микробиологических и

вирусологических исследованиях имеет правильная интерпретация полученных

результатов. Это особенно важно при использовании клинического материала,

когда понятия «контроль» и «опыт» часто определяются с большой долей

субъективизма. Для тестирования положительных проб вначале ставят 6-8

тестов на образцах, взятых от заведомо здоровых людей и определяют среднюю

оптическую плотность контроля и стандартное отклонение при естественном

разбросе данных за счет различных методических погрешностей. Проба обычно

считается положительной, если отклонение ее оптической плотности от

контроля в 3 раза превышает стандартное.

Иммуносенсоры

Впервые принцип иммуносенсоров был использован М. Аizawа и соавт. (1977),

когда они сконструировали мембрану, способную на иммунологический ответ. В

настоящее время опубликовано несколько сообщений об использовании

аналогичного подхода для определения различных микробных антигенов или

антител к ним [Horbach Е. еt аl, 1989, Parry R. еt аl., 1990].

Принцип методов, основанных на иммуносенсорной технологии, заключается в

изменении физико-химических свойств мембраны или другого носителя,

связанного с антителами или антигенами. Уменьшение мембранного потенциала,

изменение оптических или химических свойств среды, прилегающей к носителю,

выявляются с помощью специального электрода или оптического устройства и

выражаются в виде электрического сигнала.

Существует два основных типа иммуносенсоров, различающихся по особенностям

определения реакции антиген - антитело. 1 тип - так называемый немеченый

иммуносенсор. Такое устройство состоит из металлического электрода для

потенциометрии, покрытого полупроницаемой полимерной мембраной с

иммобилизованными на ней молекулами антител (или антигена). В результате

реакции с искомым комплементарным веществом образуются иммунные комплексы

на поверхности мембраны. Это приводит к изменению заряда мембраны и ее

поверхностного потенциала. Изменение разности потенциалов и определяется

электродом.2 тип - меченый иммуносенсор. В этом случае на мембране также

иммобилизуются антитела или антиген, но реакция определяется по изменению

проводимости (амперметрия). Для этого используют кислородный электрод,

реагирующий на изменение концентрации О2 после реакции антител с антигеном,

меченым ферментом (например, каталазой). Конкуренция искомого антигена с

известным количеством меченого конъюгата дает изменение проводимости

раствора в области мембраны, что реализуется в виде электрического сигнала

на выходе электрода. В другой модификации результат цветной ферментативной

реакции может быть определен и с помощью оптического устройства.

Для оценки результатов реакции в двух описанных типах иммуносенсоров

значительно реже используют пьезоэлектрический эффект, измерение

температурных колебаний и некоторые другие способы, менее разработанные в

сравнении с электрохимическими и оптическими.

Особенностью иммуносенсоров, отличающей их от других систем

иммунохимической диагностики, является то, что информация о возникновении

иммунного комплекса непосредственно реализуется в виде физического сигнала

- изменения разницы потенциалов, оптической плотности, силы тока и т. п.

Одним из первых применений иммуносенсоров было измерение количества антител

при сифилисе. Для этого на полупроницаемой мембране электрода связывали

антигены трепонемы и инкубировали его в растворе сыворотки крови. Изменения

разницы потенциалов наблюдали вплоть до разведения положительной

контрольной сыворотки 1:800, причем, увеличение сигнала соответствовало

повышению концентрации антител. Важно то, что после отмывания иммуносенсор

можно использовать вновь. Аналогичный подход был применен для определения

антител другой специфичности (к групповым антигенам крови) и альбумина.

Более сложное строение иммуносенсора увеличивает чувствительность анализа.

Так при использовании меченого иммуносенсора достигается чувствительность

до 0,1 нг белка/мл. Имеются данные об определении таким методом HBs-

антигена с помощью I-электрода и антител к HBs-антигену, меченых

пероксидазой [Аizawа М., 1987]. Устройство, включающее стеклянную матрицу,

активированную различными вирусными антигенами (биочип) было использовано

для серологической диагностики вирусных заболеваний [Ноrbach Е. еt аl.,

1989]. Предприняты попытки определять с помощью иммуносенсоров продукты

синтеза некоторых грибов (охратоксин А), клетки С. Albicans.

Хотя в настоящее время отсутствуют коммерческие образцы иммуносенсоров

для диагностики инфекционных заболеваний, следует обратить внимание на

основные этапы использования подобных устройств.

Опыт использования аналогичных систем для определения глюкозы в крови,

гормонов, низкомолекулярных веществ позволяет разделить процесс анализа на

три этапа:

1 - подготовка образца для анализа

Некоторые типы иммуносенсоров способны взаимодействовать

непосредственно с биологическим материалом. Однако чаще всего используется

предварительно отделенная центрифугированием плазма или сыворотка крови,

разведенная специальным раствором.

2 - проведение аналитической процедуры

Помещая каплю раствора на микроэлектрод, или опуская электрод в

исследуемый образец, создается контакт реагентов. Время достижения

равновесия от нескольких секунд (для низкомолекулярных веществ) до

нескольких минут (для высокомолекулярных агентов, антигенов, клеток).

Результат определяется по разнице в показаниях с референс-электродом или по

изменению сигнала после реакции. Результат может быть выражен в

систематических единицах (милливольт, миллиампер), либо с помощью

микропроцессора трансформирован в единицы концентрации искомого агента, в

соответствии с предварительным калиброванием.

3 - регенерация иммуносенсора

Для повторного или многократного использования иммуносенсора

необходимо освободить его рабочую поверхность от веществ, активно или

пассивно сорбированных в ходе анализа. Наиболее простой способ регенерации

состоит в интенсивном последовательном промывании иммуносенсора раствором с

кислым значением рН и буферным раствором с высокой ионной силой. Для

некоторых типов иммуносенсоров до сих пор не найдено оптимальных условий

регенерации, не снижающих их чувствительность. В этих случаях используют

сменные одноразовые мембранные элементы.

В ближайшее время будут созданы надежные портативные иммуносенсоры для

диагностики наиболее распространенных инфекционных заболеваний, как это

сделано уже для анализаторов глюкозы.

МЕТОДЫ ГЕННОГО ЗОНДИРОВАНИЯ

Интенсивное развитие молекулярной биологии и создание совершенной

методической базы генетических исследований явились основой генетической

инженерии. В области диагностики возникло и бурно развивается направление

по определению специфических нуклеотидных последовательностей ДНК и РНК,

так называемое генное зондирование. В основе подобных методик лежит

способность нуклеиновых кислот к гибридизации - образованию двухцепочных

структур за счет взаимодействия комплементарных нуклеотидов (А-Т, Г-Ц).

Для определения искомой последовательности ДНК (или РНК) специально

создается, так называемый, зонд полинуклеотид с определенной

последовательностью оснований. В его состав вводят специальную метку,

позволяющую идентифицировать образование комплекса. Схема реакции

представлена на рисунке.

[pic]

Рис. Схема реакции генного зондирования для обнаружения в образцах

ДНК или РНК микроба специфическим меченым зондом.

Хотя генное зондирование нельзя отнести к методам иммунохимического

анализа, основной его принцип (взаимодействие комплементарных структур)

методически реализуется теми же способами, что и индикаторные методы

иммунодиагностики. Кроме того, методы генного зондирования позволяют

восполнить информацию об инфекционном агенте в отсутствии его

фенотипической экспрессии (вирусы, встроенные в геном, «молчащие» гены).

Первые сообщения об использовании зондов были связаны с чисто

исследовательскими задачами молекулярной биологии - контролем наличия тех

или иных последовательностей ДНК в общем пуле клеточной ДНК. Различают

несколько разновидностей генного зондирования: гибридизация по Саузерну

(анализ ДНК), Nothern-блот (анализ РНК), точечная гибридизация,

гибридизация in situ. (на срезе, в мазке)

Для проведения анализа ДНК пробу подвергают денатурации с целью

получения одноцепочных структур, с которыми и реагируют молекулы ДНК- или

РНК-зонда. Для приготовления зондов используют либо различные участки ДНК

(или РНК), выделенные из естественного источника (например, того или иного

микроорганизма), как правило представленные в виде генетических

последовательностей в составе векторных плазмид, либо химически

синтезированные олигонуклеотиды. В некоторых случаях в качестве зонда

применяют препараты геномной ДНК, гидролизованной на фрагменты, иногда -

препараты РНК, особенно часто - рибосомальная РНК [Stull T.1988].

В качестве метки используют те же индикаторы, что и при различных

видах иммунохимического анализа: радиоактивные изотопы, флуоресцеины,

биотоп (с дальнейшим проявлением комплексом авидин-фермент) и т. п.

Порядок проведения анализа определяется свойствами имеющегося зонда. В

исследовательских лабораториях используют ДНК-зонды, приготовленные

самостоятельно и меченые, как правило, радиоактивным фосфором (32Р). В

настоящее время все чаще применяются коммерческие наборы, содержащие все

необходимые ингредиенты.

В большинстве случаев процедуру проведения анализа можно разделить на

следующие стадии: подготовка образцов (в том числе экстракция и денатурация

ДНК), фиксация пробы на носителе (чаще всего - полимерный мембранный

фильтр), предгибридизация, собственно гибридизация, отмывание

несвязавшихся продуктов, детекция. При отсутствии стандартного препарата

ДНК- или РНК-зонда предварительно проводится его получение и введение

метки.

Для подготовки пробы может быть необходимо предварительное

«подращивание» исследуемого материала для идентификации отдельных колоний

бактерий или увеличения концентрации вирусов в клеточной культуре.

Проводится и непосредственный анализ образцов сыворотки крови, мочи,

уретральных соскобов, форменных элементов крови или цельной крови на

присутствие инфекционного агента. Для освобождения нуклеиновых кислот из

состава клеточных структур проводят лизис клеток, а в некоторых случаях

очищают препарат ДНК с помощью фенола. Денатурация ДНК, т. е. переход ее в

одноцепочную форму, происходит при обработке щелочью. Затем образец

нуклеиновых кислот фиксируют на носителе - нитроцеллюлезной или нейлоновой

мембране, обычно путем инкубации от 10 мин до 4 час при 80 С0 в вакууме.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5