твердофазные методики позволяют избавиться от балластных, не вошедших в

иммунный комплекс антигенов простой промывкой.

Необходимо отметить, что в своей физико-химической основе твердофазный

ИФА очень сходен с твердофазным РИА. Отличие касается лишь индикаторных

молекул - в ТФИФА это фермент, в твердофазном РИА это радиоактивные

изотопы. Остальные же принципы анализа полностью совпадают - в обоих

методах используется твердая матрица, на которой адсорбируется иммунный

комплекс, и идентичный способ удаления из системы не вошедших в комплекс

компонентов диагностикума.

В настоящее время уже опубликованы обзоры, подробно анализирующие

схемы проведения диагностических исследований с использованием метода

твердофазного ИФА.

Для обнаружения в биологических и клинических образцах бактериальных и

вирусных антигенов особенно часто применяется так называемый сэндвич-метод

или модифицированный сэндвич-метод. При использовании этих методик на

твердую подложку (обычно полистирол) сорбируются последовательно первичные

антитела, выявляемый антиген и вторичные антитела. В случае двойного

сэндвич-метода ферментная метка вводится в состав вторичных антител, в

случае модифицированного двойного сэндвич-метода вторичные антитела

(немеченые) «проявляются» антивидовыми меченными ферментом

иммуноглобулинами. Особая популярность последней разновидности ТФИФА

объясняется тем, что для выполнения методики нет необходимости

синтезировать специфические для каждого конкретного антигена конъюгаты

(меченные ферментом антитела).

В последние годы были разработаны методики ТФИФА, использующие в

качестве «проявляющих» конъюгатов молекулярные комплексы ферментов с белком

А золотистого стафилококка. Как известно, это белок взаимодействует с

высокой константой связывания с тяжелой цепью (Fс-фрагментами)

иммуноглобулинов. Это позволяет построить диагностические системы, где - в

качестве «проявляющего» агента используются не антивидовые антитела, а

белок А. В этом случае, однако, возникают некоторые трудности, связанные с

неспецифичностью белка А, который взаимодействует с Fс-фрагментами любых

антител. Если использовать обычную сэндвич-методику, заменив лишь

антивидовой конъюгат на конъюгат на основе белка А, последний будет

взаимодействовать не только со вторичными антителами, но и с первичными

иммуноглобулинами, давая положительную реакцию, даже если проба не содержит

искомого антигена. В этом случае имеется несколько вариантов решения

проблемы. Во-первых, в качестве первичных антител в методике можно

использовать иммуноглобулины, с которыми белок А взаимодействует слабо

(например, с мышиными иммуноглобулинами). Во-вторых, возможна прямая

адсорбция антигена на полистирол, когда первичные антитела просто не

используются. И, наконец, в качестве первичных антител можно применять не

полные молекулы иммуноглобулинов, а молекулы, лишенные Fс-фрагментов, - так

называемые Раb2 -фрагменты. В этом последнем случае дополнительным

удобством методики будет являться то, что для конструирования

диагностической системы можно будет использовать не две сыворотки,

полученные от разных животных, а одну. Именно в связи с этими

обстоятельствами в настоящее время разработано и разрабатывается большое

число диагностических методик, использующих конъюгаты на основе белка А.

Построение диагностикумов для серодиагностики бактериальных и вирусных

заболеваний, выявление и идентификация с их помощью антител в

биологических и клинических образцах проводится аналогичным образом.

Обычно приготовляется так называемый иммуносорбент - антиген,

иммобилизованный на твердом носителе (либо за счет его прямой сорбции на

твердую матрицу, либо за счет ковалентной «пришивки» к этой матрице, либо

за счет иммуносорбции на иммобилизованные первичные антитела). Затем

исследуемая сыворотка, содержащая или не содержащая выявляемые антитела,

контактирует с иммуносорбентом. Степень адсорбции специфических к

иммобилизованному антигену иммуноглобулинов обычно определяется с помощью

антивидовых конъюгатов. Использование антивидовых антител к различным

классам иммуноглобулинов позволяет выявить в исследуемом образце не только

специфические к использованному антигену антитела, но и провести их

изотиповой анализ.

Конкретные методики диагностики и серодиагностики заболеваний

бактериальной и вирусной природы, использующие иммуноферментные подходы,

отличаются многими параметрами, в частности, типом и формой адсорбента, на

котором иммобилизуется иммунный комплекс. В качестве твердофазного носителя

может использоваться целый ряд полимеров: полиметилметакрилат., и нейлон,

тефлон, полипропилен и др. Однако наиболее часто в качестве адсорбента в

настоящее время применяется полистирол и поливинилхлорид. Для удобства

проведения анализа эти адсорбенты производятся в виде многолуночных плашек,

шариков или палочек. Использование плашек, изготовленных из оптически

прозрачного полистирола или поливинилхлорида позволяет проводить все

операции ТФИФА, включая конечное фотометрирование хромофорной субстратной

смеси. Не менее существенным преимуществом полистироловых плашек перед

другими формами адсорбента является возможность автоматизации практически

всех операций анализа, включая трудоемкие этапы промывки лунок и внесения в

них однотипных реагентов.

Следует отметить, что использование полистироловых плашек для целей

ТФИФА имеет и некоторые недостатки - высокие требования к чистоте

полимерного материала и точности изготовления плашек и нерентабельность их

использования для одиночных анализов.

Большое внимание при постановке ТФИФА обычно уделяется правильному

выбору фермент-субстратной системы. В современных диагностических

иммуноферментных тест-системах используется большое число разнообразных

ферментов и субстратов. Выбор той или иной фермент-субстратной пары для

использования в конкретной тест-системе на основе ТФИФА диктуется

несколькими соображениями. Во-первых, обращается внимание на стабильность в

процессе анализа и хранения как крайне чувствительного к структурным

внутримолекулярным перестройкам конъюгата, так и во многих случаях

светочувствительного хромофорного или флуорохромного субстрата. Во-вторых,

это отсутствие используемого в диагностикуме фермента или субстрата

(свободного или связанного) в биологических или клинических образцах,

которые предстоит анализировать. В-третьих, наличие соответствующей

регистрирующей аппаратуры (спектрофотометра или спектрофлуориметра). И,

наконец, в-четвертых, выбор той или иной фермент-субстратной пары диктуется

естественным желанием экспериментатора или клинициста иметь в руках

систему, обладающую максимальной специфичностью и чувствительностью.

Таблица: Фермент-субстратные системы, наиболее часто используемые в

твердофазном ИФА

|Фермент |Субстрат |Способ |Длина волны |Чуствительно|

| | | |наблюдения |сть |

| | | |(н/м) |нг/образец |

|Щелочная|Паранитрофенилфос|Фотометрия|400,405 |0,5-20 |

|фосфатаз|фат |Флуорометр|450(360) |10-4-10-2 |

|а |4-метилумбеллифер|ия |- |10-2 |

| |ил-фосфат |Радиометри| | |

| |Н-аденозинмонофос|я | | |

| |фат | | | |

|Пероксид|аминосалициловая |Фотометрия|450,474,520 |100 |

|аза |кислота | |630 |- |

| |Ортотолуидин(ОТ) |-//- |450,492 |2,5 |

| |0ртофенилендиамин|-//- |400 |20 |

| |(ОФД) |-//- |405(320) |5*105 |

| |Ортодианизидин |Флуорометр| | |

| |(ОД) |ия | | |

| |Парагидроксифенил| | | |

| |пропио - | | | |

| |новая кислота | | | |

|( |Ортонитрофенил-(-|Фотометрия|410,420 |0,01-10 |

|-галакто|D-галактозид | | | |

|зидаза |4-метилумбеллифер| |450(360) |10-6—10-2 |

| |ил-(-D-галактозид|Флуорометр| | |

| | |ия |450(360) |2*10-2 |

| |Флуоресцеин-ди | | | |

| |((-галактозид) |Флуорометр| | |

| | |ия | | |

*Для фотометрических измерений указаны только наиболее часто используемые

длины волн наблюдения; для флюорометрических измерений - длины волн

флюоресценции и возбуждения (в скобках).

Специфичность диагностической системы не зависит от выбора фермент-

субстратной пары и определяется в основном чистотой и гомогенностью

используемых при конструировании диагностикума препаратов антигенов и

антител. Использование в ТФИФА не гетерогенных антиген-содержащих

препаратов и даже не очищенных бактерий и вирусов, а индивидуальных

бактериальных и вирусных белков - вот единственный, хотя и трудоемкий путь

повышения специфичности диагностических систем. То же можно сказать и о

препаратах, используемых в ТФИФА иммуноглобулинов, - желательно

использовать не цельные сыворотки и даже не суммарные гаммаглобулиновые

фракции этих сывороток, а аффинноочищенные или моноклональные антитела.

Особой популярностью в настоящее время у нас в стране пользуются

иммуноферментные конъюгаты на основе пероксидазы хрена. Это, вероятно,

сиязано с доступностью сырья для выделения этого фермента, относительно

легкостью очистки, достаточно высокой стабильностью , и большим числом

хромофорных и флуорохромных субстратов.. Тем не менее следует подчеркнуть,

что два других достаточно часто используемых в ТФИФА фермента - щелочная

фосфатаза и (-галактозидаза - в некоторых случаях имеют целый ряд

преимуществ перед пероксидазой. Это, во-первых, высокая стабильность,

растворимость и нетоксичность субстратов, а, во-вторых, возможность

использования относительно недорогих флуорохромных субстратов, применение

которых резко повышает чувствительность анализа.

Определенное значение для реализации максимальной чувствительности ТФИФА

имеет правильный выбор субстрата. Наряду с естественным желанием

использовать субстраты с высокой удельной хромофорной активностью (высокий

коэффициент молярной экстинкции окрашенного конечного продукта) необходимо

принимать во внимание такие важные факторы, как рвстворимость субстрата и

продуктов его ферментативной модификации в условиях проведения анализа и

стабильность этих субстратов при хранении и в процессе эксперимента.

Чувствительность диагностических систем на основе ТФИФА лишь частично

зависит от типа выбранной при конструировании диагностикума фермент-

субстратной пары. В основном эта чувствительность определяется другими

факторами, которые трудно учесть: способом синтеза конъюгата, гомогенностью

и удельной активностью используемых для такого синтеза антител и антигенов,

а также многочисленными па.раметрами проведения анализа (способом

иммобилизации выявляемого антигена или антител, степенью их солюбилизации в

биологическом или клиническом образце и т. д.). Именно в связи с этим в

литературе приводится такой широкий диапазон пределов чувствительности для

уже разработанных методик ТФИФА. На основании анализа этих данных трудно

рекомендовать при конструировании вновь создаваемых твердофазных

иммуноферментных систем наилучший фермент и наулучший субстрат. Следует

лишь отметить, что с помощью использованных ранее фермент-субстратных пар

метод ТФИФА позволяет выявить в исследуемом образце нанограммовые

количества антигена при использовании хромофорных субстратов и

пикограммовые количества антигена при применении флюорохромных субстратов.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5