p align="left">Принцип метода основан на учете характера изменения оптической плотности МПБ или РПБ при росте на нем микробов с добавлением или без добавления испытуемой сыворотки с помощью фотоэлектрического колориметра или спектрофотометра. Оборудование и реактивы: пипетки стерильные на 1,0 мл; МПБ или РПБ стерильный в пробирках по 2,5 и 3,0 мл или по 5,0 и 6,0 мл; сыворотка крови исследуемых рыб; одномиллиардная взвесь суточной культуры вирулентных бактерий a. hydrophila (можно использовать и другие виды микроорганизмов), приготовленная на 0,65%-ном стерильном растворе натрия хлорида; термостат, отрегулированный на 26°С; ФЭК-56М; пастеровские пипетки, шприцы и инъекционные иглы для взятия крови, стерильные. Материал для исследования, ход определения и учет результатов. Оценку БАСК проводят в течение 1-5 суток от момента взятия крови. Кровь для получения сыворотки собирают в стерильные пробирки каудоэкгомией, отсечением жаберных артерий или из кровеносных сосудов хвостового стебля с помощью пастеровской пипетки или шприца. Полученную кровь отстаивают при комнатной температуре 20-30 минут. После обведения сгустка крови с помощью стерильной пастеровской пипетки пробирки ставят в холодильник на 18-24 часа при + 4° С. Через сутки отделившуюся в пробирках сыворотку пастеровскими пипетками отсасывают и переносят в стерильные пробирки. Далее сыворотку центрифугируют при 3000 об/мин, в течение 10-15 минут и используют для постановки опыта. В пробирки вносят 2,5 мл МПБ или РПБ и 0,5 мл испытуемой сыворотки, а в три контрольные пробирки 3,0 мл среды. Затем пастеровской пипеткой во все пробирки добавляют по 2 капли одномиллиардной взвеси суточной культуры тест - бактерий. Содержимое пробирок тщательно перемешивают, отбирают по 3.0 мл смеси и определяют оптическую плотность на ФЭК. После этого пробы помещают в термостат при 26°С на 3 часа, после чего вновь измеряют оптическую плотность их содержимого. В пробирках с активной сывороткой крови оптическая плотность остается на прежнем уровне или незначительно повышается. При слабой бактерицидной активности сыворотки оптическая плотность среды возрастает за счет накопления в ней размножающихся микробов. В контрольных пробирках оптическая плотность среды возрастает. БАСК выражают через изменения оптической плотности контрольных и подопытных проб, отражающие угнстсние роста бактерий в присутствии сыворотки, и рассчитывают по формуле: БАСК(%) = 100 х -dek ~ de ° ,
где de, d Ек - разность оптической плотности второго и первого измерений в контрольных пробирках; deo - разность оптической плотности второго и первого измерений оптической плотности в опытных пробирках. 100-коэффициснт перевода оптической плотности в %. 2.2.2. Определение гемолитической активности комплемента
В качестве тест-объекта для определения активности комплемента in vitro используют эритроциты барана (по классическому пути) и эритроциты кролика (по альтернативному пути). Активность комплемента обычно выражается в условных единицах. За одну 50 % гемолитическуго единицу (СНад) принимается количество комплемента, необходимое для 50 %-го лизиса эритроцитов. Эта единица является условной, поскольку зависит от концентрации эритроцитов, количества сенсибилизирующих антител (для классического пути), величины ионной силы среды, концентрации Са^ и mg21, ph, времени и температуры реакции. Для каждого вида рыб подбираются оптимальные значения этих показателей. Отношение между количеством взятого комплемента и долей лизи-рованных клеток нс является линейным, а выражается сигмовидной кривой, для математического описания которой используется уравнение: Х = К (y/l-y)17"
где: Х - количество комплемента (мл) в реакции; у - степень лизиса, выраженная в долях единицы; К -константа, соответствующая ichso при у = 0,5; 1/п-константа (определяет наклон кривой, зависит от условий опыта). При логарифмировании этого уравнения получается функция, удобная для оценки результатов: igx =lgk+l/n[lg(y/l-y)] Зависимость величины lg Х от величины lg(y/l-y) графически будет представлять прямую линию, по которой можно определить искомую величину К. Зная величину К, легко рассчитать количество chsn, содержащихся в 1 мл неразведенной сыворотки. 2.2.2.1. Определение гемолитической активности комплемента по классическому пути активации (метод Мейера в модификации yano Т., 1992). - Принцип метода основан на способности комплемента присоеди- няться к комплексу антиген - антитело (эритроциты барана - гемолизин) и вьвывать специфический гемолиэ сенсибилизированных эритроцитов.
За единицу активности (по Мейеру) комплемента теплокровных принимают такое количество неразведенной сыворотки, которое вызывает 50 % лизис 5х108 оптимально сенсибилизированных эритроцитов барана в желатин - вероналовом буфере (рН 7,4), содержащем 0,15 mm Са2* и 0,5 mm mg24", в течение 60 мин инкубации при 37° С в объеме 7,5 мл. По yano Т., в зависимости от вида рыб, инкубацию осуществляют при 20- 25° С в течение 60-120 мин в желатин-вероналовом буфере (рН 7,3 -7,4), содержащем 0,5 mm Са2^ и 1 mm mg^ в объеме 1,5 мл. Для сенси- билизации эритроцитов используют гемолизин того же (или близкого) вида рыб, что и испытуемый комплемент. - Оборудование и реактивы: спектрофотометр и кюветы с длиной оптического пути 1 см (при использовании приборов с иной длиной опти- ческого пути необходимо определить и использовать в расчетах величину оптической плотности (od) для заданной концентрации эритроцитов); рН - метр; водяная баня; дозирующие микропипетки на 0,2; 1, 2 мл; про- бирки (5-10 мл), выдерживающие центрифугирование; рефрижераторная центрифуга; стерильные шприцы; глюкоза; naci; дистиллированная вода; na-5,5,- диэтилбарбитурат (мединал); cacl2; mgcl2; желатин; in hc1; ледяная уксусная кислота; ацетат натрия; edta; 10 % МаЖ)з; эритроциты барана в растворе Олсвера (1:1); гемолизин;сыворотка крови рыб (источник комплемента); 0.85% naci; маточный раствор солей (СаСЬ х 2НгО - 7.35 г, mgcl-i x 6h20 - 20.33 г, дистиллированная вода до 100 мл). - Приготовление буферных растворов: - Вероналовый буфер, концентрат, рН 7,3-7.4 (5vb): naci - 41,5 г, Ма-5,5-диэтилбарбитурат - 5,1 г, in hc1 - 17.5 мл, дистиллированная вода -1 л. Желатин-вероналовый буфер (gvb^): желатин - 0,1 г, 5vb - 20 мл, маточный раствор солей - 0,1 мл, дистиллированная вода до 100 мл (хранить при +4°С не более 1 недели) Глюкозо-желатин-вероналовый буфер (ggvb24): желатин - 0.1 г, 5vb - 10 мл, глюкоза - 2,5 г, маточный раствор солей -- 0,1 мл, 10% nanos - 0,2 мл, дистиллированная вода до 100 мл (хранить при +4° С не более 1 недели). - 0,1 М edta буфер, рН 7<5: 2Д2 г edta растворить в 90 мл дистиллированной воды, добавляя концентрированный раствор naoh, довести рН до 7.5, долить дистиллированной воды до 100 мл. - 0,01 М edta-желатин-вероналовый буфер (edta - gvb): желатин - 0,1 г, 5 vb - 20 мл, 0,1 М edta (рН 7,5) - 10 мл, дистилированная вода до 100 мл ( хранить при +4° С не более 1 недели). 0,001 М ацетатный буфер, рН 5,0: смешать 3 части 0,1 М уксусной кислоты с 7 частями 0,1 М ацетата натрия, развести в 100 раз, довести рН до 5,0. - Получение гемолизина. - Рыба. Для иммунизации используют неполовозрелую рыбу из благополучного хозяйства. Рыбу предварительно адаптируют и содержат в условиях наиболее оптимальных для каждого вида (температура воды, проточность, аэрация, полноценное кормление). - Приготовление стромы эритроцитов барана. 100 мл крови барана в растворе Олсвера (1:1) центрифугируют при 500-1000 g 10 мин (+ 4° С) и дважды отмывают 200 мл физраствора. Осадок эритроцитов лизируют в 1 л дистиллированной воды, содержащей 0,4 мл ледяной уксусной кислоты, в течение ночи при +4° С. Центрифугируют, затем осадок стромы промывают б раз 0,0б1 М ацетатным буфером (рН 5,0) и 1 раз физраство-ром, центрифугируя 20 мин. при 500-1000 g. Осадок тщательно ресус-певдируют в 30 мл физраствора. В суспензии определяют содержание азота микромстодом Кьельдаля и доводят концентрацию до 1 мг/мл. - Иммунизация рыб. Рыбу инъецируют в/б суспензией стромы эритроцитов из расчета 0,3-0,5 мг n/кг массы рыбы. Инъекций повторяют многократно (6-8 раз) с интервалом 5 дней. Перед каждой инъекцией (начиная с 4-5) отбирают сыворотки и определяют титр гемодизина. Количество инъекций зависит от титров полученных гемолйзинов (определение тетрагемолизина см. ниже). - Отбор антисывороток и условия хранения. Через 5 дней после последней инъекции стерильно отбирают максимальное количество крови. После образования и ретракции сгустка центрифугируют 5 мин при 1500 g. Отбирают сыворотки и разводят 1:1 gvb2^ инактивируют прогреванием (карповые-20 мин при 50° С, лососевые - 20 мин при 42-45°С), расфасовывают и хранят при -20° С и ниже. - Определение титра гемолизина. Готовят серийные 2-х кратные разведения антисывороток gvb2^ К 0,5 мл каждого разведения антисыворотки добавляют по 0,1 мл эритроцитов барана (1х109 кл/мл, см. ниже), по 0,4 мл gvb 2+ и по 0,5 мл комплемента, разведенного gvb2^ 1:20-1:40 (в качестве комплемента используют свежую сыворотку, полученную от интактных рыб того же вида). Смесь инкубируют при 20 - 25° С в зависимости от вида рыб (карповые - 25°С - 60 минут, лососевые - 20° -120 минут), центрифугируют 5 минут при 1600 g, определяют оптическую плотность (od541) супернатанта и рассчитывают степень гемолиза. За титр гемолизина принимают разведение, дающее 50 % гемолиз. - Получение и условия хранения комплемента. Комплемент рыб очень термолабилен и быстро инактивируется даже при 0° С (несколько часов), не переносит замораживания при минус 20° С, при минус 35° С активность сохраняется в течение месяца. Кровь после отбора оставляют на 30 мин при комнатной температуре, затем на 1 час при 0°С (лед с водой) для ретракции сгустка, центрифугируют 5 мин при 1500 g (0° ...+4° С) и отбирают сыворотки. Сыворотки как источник комплемента используют немедленно, а при необходимости хранят при -80° С или лиофилизируют. - Приготовление суспензии эритроцитов. Эритроциты барана в растворе Олсвера (1:1) трижды отмывают edta-gvb и готовят 5% суспензию в gvb2^ К 0,1 мл 5 % суспензии эритроцитов добавляют 1,4 мл дистиллированной воды, после лизиса эритроцитов измеряют ods4i против дистиллированной воды. Необходимой концентрации эритроцитов барана 1х109 кл/мл соответствует 0d541 0,680 при длине оптического пути 1 см. Если 5 % суспензия не дает необходимого значения od541, значит ее необходимо развести (если od541<0,680) или сконцентрировать (если od541>0,680) во столько раз, во сколько полученное ods4i отличается от 0,680. - Подбор разведения гемолизина для оптимальной сенсибилизации эритроцитов. Готовят серийные двукратные разведения гемолизина (используют гемолизин с титром 1:1500 и выше) на gvb2'. Берут 2-4 ряда пробирок. В каждый ряд вносят по 0,1 мл/пробирку приготовленные разведения гемолизина. Во все пробирки добавляют по 0,1 мл суспензии эритроцитов. Встряхивают и инкубируют при 25° С 20 мин. Готовят несколько разведении комплемента на gvb24 - на каждый ряд свое разведение. Величина разведения зависит от вида рыб и активности комплемента (1:15 - 1:80). В каждую пробирку ряда вносят по 1,3 мл комплемента одного и того же разведения. Инкубируют 60 мин при 25° С (для кар- па), 120 мин при 20° С (для лососевых), 120 мин при 25° С (для тиляпии), периодически встряхивая. Центрифугируют 5 мин при 16ДО g, определяют od541 и рассчитывают процент гемолиза супернатанта для каждой пробирки. Для каждого разведения комплемента строят график зависимости процента гемолиза от разведения гемолизина. Выбирают кривую с таким разведением комплемента, при котором максимальный гемолиз составляет 50-70% (т.е. кривая выходит на плато при гемолизе 50-70%). За оптимальное разведение гемолизнна принимают максимальное разведение, вызывающее максимальный % гемолиза (выход кривой на плато) и для надежности это разведение уменьшают в 2 раза (например, кривая выходит на плато при разведении гемолизина 1:800, а за оптимальное принимают разведение 1:400). - Приготовление сенсибилизированных эритроцитов. Готовят оптимальное разведение гемолизина в edta-gvb. Это разведение медленно добавляют (при постоянном помешивании) к равному объему суспензии эритроцитов (1х109 кл/мл в edta-gvb) и инкубируют 30 мин при 25° С. Сенсибилизированные эритроциты отмывают в ggvb2^, центрифугируют 5-10 мин при 500g и готовят суспензию эритроцитов в ggvb^ с концентрацией 5х108 кл/мл. Концентрацию эритроцитов контролируют, измеряя ods4i лизированных клеток (0,2 мл суспензии сенсибилизированных эритроцитов + 1,3 мл дистиллированной воды дают ods4i, равную 0,680). Сенсибилизированные эритроциты хранят при +4° С в течение 1 недели. - Техника постановки реакции и расчет активности комплемента. Все компоненты реакции смешивают при 0° С (лед с водой). Испытуемый комплемент разводят gvb24 в зависимости от предполагаемой его активности, чтобы попасть в область 50% лизиса (для карпа обычно 1/40 - 1/60, для лососевых - 1/60 - 1/80). Берут ряд из 8 пробирок. В 5 пробирок вносят разные объемы разведенного испытуемого комплемента (0,4; 0.5; 0.6; 0.8; 1.0 мл), gvb21 доводят объем до 1,3 мл, в каждую пробирку добавляют по 0.2 мл сенсибилизированных эритроцитов. Три пробирки используют для контролей: 1 -контроль эритроцитов на спонтанный лизис (0.2 мл сенсибилизированных эритроцитов + 1.3 мл gvb^); 2 - 100% лизис эритроцитов (0.2 мл суспензии сенсибилизированных эритроцитов + 1.3 мл дистиллированной воды); 3 - контроль od.541 комплемента (1.0 мл разведенного комплемента + 0.5 мл gvb^).
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5
|