гемоглобином, является лишь первым, хотя и очень важным приближением к

истине. Так, например, быстрое восстановление железа в ферригемоглобине

коротким (микро- или наносекунды) импульсом электронов приводит к

возникновению неравновесного состояния, в котором железо уже восстановлено,

но не отошло от плоскости порфиринового кольца. По спектральным и магнитным

характеристикам это состояние соответствует равновесному оксигемоглобину.

Релаксация гема и его ближайшего окружения с удалением железа от плоскости

порфиринового кольца занимает при комнатной температуре десятки

микросекунд, а полная релаксация всей белковой глобулы к равновесной Т-

форме дезоксигемоглобина — сотни миллисекунд.

Рис. 5. Структурная схема перехода гемоглобина от Т- к R-форме

Другие реакции и функции гемоглобина При взаимодействии молекулярного

кислорода с гемоглобином существует небольшая, но конечная вероятность

окисления последнего: молекула О2 не присоединится, но окислит железо: Fe2+

+ O2 ( Fe3+ O2(. Поэтому при дыхании в эритроцитах непрерывно образуется

метгемоглобин. Для его восстановления в эритроците существует специальная

ферментативная система, восстанавливающая метгемоглобин и превращающая его

в нормальный дезоксигемоглобин. При нарушении этой системы возникает

тяжелое заболевание — метгемоглобинемия, при котором гемоглобин перестает

быть переносчиком кислорода.

Гены, ответственные за синтез гемоглобина, могут подвергаться мутациям,

меняющим структуру и функции белка. Наиболее изучена мутация, приводящая к

замене только одной аминокислоты в полпептидных цепочках (-субъединиц

гемоглобина. Замена глутамина на валин ведет к тяжелой болезни –

серповидноклеточной анемии: эритроциты принимают форму серпа и теряют

способность переносить кислород.

Присоединение кислорода меняет кислотно-основные свойства гемоглобина.

Оксигемоглобин является более сильной кислотой, чем дезоксигемоглобин.

Поэтому в тканях, где значительная часть гемоглобина теряет кислород и

становится более сильным основанием, гемоглобин связывает образующуюся в

ходе метаболических внутриклеточных процессов углекислоту. В альвеолах

легких дезоксигемоглобин снова превращается в оксигемоглобин, становится

более сильной кислотой и способствует отщеплению СО2. Это слегка упрощенное

описание важного процесса транспорта углекислоты эритроцитами. Углекислота,

освобождаемая тканями, недостаточно хорошо растворима для эффективного

переноса. С помощью фермента карбоангидразы, ускоряющего прямую и обратную

реакцию

СО2+Н2О(НСО3(+Н+ (8)

двуокись углерода превращается в хорошо растворимый бикарбонат-анион. В

капиллярах тканей отщепление кислорода повышает содержание

дезоксигемоглобина, связывающего протоны и смещающего, таким образом,

равновесие реакции (8) вправо. Легко растворимый ион бикарбоната

переносится кровью. В альвеолах легких гемоглобин оксигенируется, протоны

освобождаются и равновесие (8) смещается влево. Образуется плохо

растворимая двуокись углерода СО2, которая удаляется из водной фазы и

выдыхается. Таким образом, гемоглобин работает как буфер с переменным

значением pK. Функция гемоглобина как переносчика углекислоты не менее

важна, чем его функция переносчика кислорода.

Гемоглобин – одно из наиболее хорошо изученных белков. Десятки лет

исследований гемоглобина в описании и понимании физических, химических и

биологических аспектов его функционирования. Огромный вклад внесли работы

Макса Перутца и его сотрудников в Кавендишской лаборатории (Кембридж,

Великобритания). Однако важность этих работ касается не только гемоглобина.

Они послужили основой развития современных представлений о механизмах

ферментативного катализа, связав непосредственно кинетику и термодинамику

биохимических реакций с динамикой конформационных изменений макромолекул

белка. Если отвлечься от непосредственной практической пользы полученных

результатов для медицины, фармакологии, то фундаментальное значение работ

по изучению механизма функционирования гемоглобина заключается в

стимулировании прогресса в установлении законов протекания важнейших

процессов: ферментативного катализа и внутриклеточной трансформации энергии

в биологических системах. [2]

Об участии гемоглобина в мембранной организации эритроцитов

свидетельствует феномен образования серповидной и других форм эритроцитов

при различных гемоглобинопатиях, первооснову которого и составляет

аномальное взаимодействие эритроцитарной мембраны с мутантными

гемоглобинами. Не исключено, что изменение упруго-механических свойств

эритроцитарных мемран при повышении отрицательного заряда их внешней

поверхности происходит вследствие улучшения условий для создания и

структурирования белкового слоя, формируемого с участием гемоглобина на

внутренней поверхности эритроцитарных мембран. [13]

Показано, что при получении безгемоглобиновых теней эритроцитов в

препаратах электронно-микроскопически обнаруживается большое количество

везикул диаметром примерно 100 нм, что свидетельствует о частичной

фрагментации плазматической мембраны эритроцитов. В то же время если в

мембранах содержится много гемоглобина и других белков, обнаруживаемых в

примембранных слоях, то фрагментации мембраны определяемой таким образом,

не наблюдается. Имеются и другие доказательства стабилизирующего действия

гемоглобина на эритроцитарные мембраны. Например, S.Knutton и соавторам

удалось получить две фракции эритроцитарных мембран, различающихся

содержанием связанного с ними гемоглобина. Ими было показано, что во

фракции эритроцитарных мембран с большим содержанием гемоглобина разрушение

липопротеиновой структуры мембран при их дегидротации происходит намного

слабее, чем в случае с фракцией эритроцитарных мембран с малым содержанием

гемоглобина. В основе изменения условий для структурирования белково-

образующего примембранного слоя внутри эритроцитов может лежать изменение

электрических поверхностных свойств на внешней стороне. Это возможно

вследствие того, что для мембран в липидной зоне дебаевский радиус

экранировки зарядов гораздо больше ее толщины, в результате поверхностные

заряды с обеих сторон эритроцитарных мембран взаимно влияют друг на друга,

образуя самосогласованную систему. Кроме того, условия для образования

белкового слоя, стабилизирующего мембраны эритроцитов, могут изменяться и в

результате защелачивания их внутренней среды, что имеет место при

суспендировании эритроцитов в щелочной или неэлектролитной среде, например,

сахарозной. Это может способствовать гемоглобину и другим примембранным

белкам за счет изменения их свойств образовывать прочный примембранный

белковый слой (в отношении гемоглобина, например, известно, что его

свойства, в том числе кислородосвязывающие, сильно изменяются при

варьировании рН). Вместе с тем защелачивание внутренней среды эритроцитов

не всегда может служить фактором, стабилизирующим их структуру. В

литературе, например, утверждают, что для эритроцитов новорожденного

теленка, для которых характерно наличие фетального гемоглобина, любые

экспериментальные манипуляции, результатом которых является внутриклеточное

защелачивание среды, вызывают их самопроизвольный гемолиз. По мере развития

организма теленка (2-3 месяца жизни) эритроциты с нормальным гемоглобином,

появляющиеся взамен вытесняемых из кровеносного русла клеток, содержащих

фетальный гемоглобин, становятся устойчивыми к внутриклеточному

защелачиванию их среды. При этом важно отметить, что, по данным литературы,

в гемолизе фетальных эритроцитов при защелачивании их внутренней среды,

помимо фетального гемоглобина, определенная роль принадлежит и мембранному

белку band III. [13]

Приведенные литературные данные дают основание сделать вывод о тесной

взаимосвязи процессов метаболизма, трансмембранного транспорта, изменений

формы и механических свойств эритроцита, что, по-видимому, позволяет

организму осуществлять координированную регуляцию функционирования клетки

через соответствующие рецепторные структуры, имеющиеся на наружной

поверхности мембраны. [9]

Таким образом, в поддержании структурной целостности эритроцитов важное

значение имеют внутренние примембранные белковые слои, структура и

взаимодействие которых с эритроцитарными мембранами взаимно обусловлены и в

целом представляют собой единую структурную организацию. Поэтому всякая

модификация как самой мембраны, так и содержащегося в них гемоглобина в

конечном счете сопровождается и модификацией этой особой организации,

частным примером проявления которой может быть изменение ее механических

свойств. [13] Приведенные данные побудили нас провести исследование с целью

оценки количественного содержания мембрансвязанного гемоглобина эритроцитов

человека и его связи со структурными белками.

материал и методы исследования

Материал исследования

Материалом настоящего исследования послужили эритроциты 124 практически

здоровых лиц, проживающих в городе Курске, в возрасте от 18 до 47 лет.

Набор добровольцев проводился при исключении любой соматопатологии.

У обследуемых проводился забор крови из локтевой вены в сухую стерильную

посуду в количестве 5-7 мл с целью получения образов эритроцитарных

мембран.

Методы исследования

Для достижения поставленной цели и решения задач настоящей работы

использовался комплекс методов.

Биохимические методы.

Реактивы и биоматериалы. В работе использовались: декстран Т-500 фирмы

"SIGMA" (США), HBS – целлюлоза фирмы "SIGMA" (США), гидрофосфат натрия,

хлористый натрий, мочевина фирмы "Bio-Rad" (США), трис, 2 – меркаптоэтанол,

персульфат аммония "Reanal" (Венгрия), додецилсульфат натрия (ДДС) фирмы

"Диа-Фарм" (Россия), акриламид "SIGMA" (США), N,N( - метилен бисакриламид

"FLUKA" (Швейцария), кумасси G – 250 фирмы "Serva" (ФРГ), бромфеноловый

синий, ТЕМЕД, глицин, набор белков для определения молекулярного веса MS-2

(Россия).

Реактивы отечественного производства были марки "ХЧ" и "ОСЧ".

Получение эритроцитов. Эритроциты получали из 5 мл гепаринизированной

крови по методу Бейтлера с незначительной модификацией. [14] Сначала

гепаринизированную кровь отстаивали дважды в растворе PBS, содержащем 3%

декстран Т –500, в течение 30 минут. Затем эритроцитарную массу подвергали

дополнительной очистке, пропуская ее через колонку с HBS-целлюлозой, после

чего эритроциты ценрифугировали при 3000 оборотах в минуту. Далее из

полученной очищенной массы эритроцитов проводили выделение мембран.

Выделение мембран. Для получения препаратов мембран эритроциты разрушали

осмотическим шоком по методу Dodge с небольшой модификацией, заключавшейся

в том, что гемолиз эритроцитов и отмывку "теней" проводили двукратно в 10

мМ Na – фосфатном буфере с добавлением ингибитора протеназ PMSF. После

этого мембраны эритроцитов лиофилизировали и хранили при -20(С.

Одномерный электрофорез по Лэммли. Электрофорез в присутствии ДДС

проводили модифицированным методом методом Лэммли. [14] Для этой цели

использовали следующие растворы:

1. 60% акриламид –0,8% метилен бисакриламид.

2. Буфер для разделяющего геля: 1 М трис – HCI (pH 8,8).

3. Буфер для концентрирующего геля: 0,5 М трис – HCI (pH 6,8).

4. 10% додецилсульфат натрия.

5. 10% персульфат аммония.

6. ТЕМЕД.

7. Электродный буфер для ЭФ: 0,025М трис, 0,193М глицин, 0,1%

додецилсульфат натрия.

Растворы хранились при +4(С две-три недели. Раствор 5 готовился перед

использованием.

Электрофорез проводили в пластинах ПААГ размером 180х180х1мм,

приготовленных с линейным градиентом концентрации акриламида 5 - 25%.

Для приготовления одной пластины ПААГ брали: 0,85 мл раствора 1, 5,5 мл

дистиллированной воды, 3,6 мл раствора 2, 101 мкл раствора 4, 5 мкл

раствора 6 и 20 мкл раствора 5 (легкий раствор, 5%). В тяжелом (25%)

растворе в отличие от легкого бралось 4,2 мл раствора 1 и 2,6 мл

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5