реконструированные яйцеклетки культивировали in vitro до стадии
бластоцисты и пересаживали в матку самок. Из 16-ти пересаженных бластоцист три
развились во взрослых животных. В следующей работе (1982) эти же авторы
использовали в качестве доноров ядер клетки эмбрионов еще более поздних стадий
(7 суток) и будто бы получили трех половозрелых мышей. Однако никто из
работающих в том же направлении не смог добиться подобных результатов, и
достоверность данных Илменси и Хоппе была вновь поставлена под сомнение.
МакГрат и Солтер показали, что ядра 8-клеточных зародышей и клеток внутренней
клеточной массы бластоцисты не обеспечивают развитие in vitro
реконструированных яйцеклеток даже до стадии морулы, которая предшествует стадии
бластоцисты. Небольшая часть (5%) ядер 4-клеточных зародышей дает возможность
развиваться только до стадии морулы. В то же время 19% реконструированных
яйцеклеток, содержащих ядра 2-клеточных зародышей, смогли достичь стадии морулы
или бластоцисты.
Эти и многие другие данные показывают, что в эмбриогенезе у мышей клеточные
ядра рано теряют тотипотентность, что связано, очевидно, с очень ранней
активацией генома зародыша - уже на стадии 2-х клеток. У других
млекопитающих, в частности, у кроликов, овец и крупного рогатого скота,
активация первой группы генов в эмбриогенезе происходит позднее, на 8-16-
клеточной стадии. Возможно поэтому первые значительные успехи в клонировании
эмбрионов были достигнуты на других видах млекопитающих, а не на мышах. Тем
не менее, работы с мышами, несмотря на их непростую судьбу, значительно
расширили наши представления о методологии клонирования млекопитающих.
Кролики, коровы и свиньи
Американские исследователи Стик и Робл, используя методику МакГрата и
Солтера, получили 6 живых кроликов, пересадив ядра 8клеточных эмбрионов одной
породы в лишенные ядра яйцеклетки кроликов другой породы. Фенотип родившихся
полностью соответствовал фенотипу донора.
Однако только 6 из 164 реконструированных яйцеклеток (3,7%) развились в
нормальных животных. Это, конечно, очень низкий выход, практически не
позволяющий рассчитывать на получение таким методом клона генетически
идентичных животных. Ценность этой работы, тем не менее, в том, что она
показала возможность клонирования эмбрионов кроликов.
Работа с реконструированными яйцеклетками крупных домашних животных, коров или
овец, идет несколько по-другому. Их сначала культивируют не in vitro, a
in vivo - в перевязанном яйцеводе овцы - промежуточного (первого)
реципиента. Затем их оттуда вымывают и трансплантируют в матку окончательного
(второго) реципиента - коровы или овцы соответственно, где их развитие
происходит до рождения детеныша. Уиладсин предложил заключать
реконструированные яйцеклетки в агаровый цилиндр, который он затем
трансплантировал в перевязанный яйцевод овцы. По данным одних авторов
реконструированные зародыши лучше развиваются в яйцеклетке, чем в культуральной
среде, хотя некоторые исследователи получили неплохие результаты и при
культивировании.
Американцы Робл и его сотрудники, используя щадящий метод извлечения ядра без
прокалывания мембраны яйцеклетки, предложенный МакГратом и Солтером,
пересаживали в зиготы так называемые кариопласты - мужской и женский
пронуклеусы вместе с окружающей их цитоплазмой, а также ядра 2-, 4- или 8-
клеточных эмбрионов коровы. Сначала зиготы центрифугировали, чтобы освободить
пронуклеусы от окружающих их гранул желтка, после чего ядра были хорошо видны
под микроскопом, что значительно облегчало их удаление. При помощи
манипулятора и заостренной стеклянной микропипетки извлекали один из
бластомеров вместе с ядром из ранних зародышей и переносили его в
энуклеированную зиготу.
Реконструированные зародыши были заключены в агаровый цилиндр и пересажены в
перевязанный яйцевод овцы. Через пять дней культивирования их вымывали,
освобождали от агара и исследовали. Реконструктурированные зародыши в этой
работе развивались только в тех случаях, когда в зиготы пересаживали
пронуклеусы: 17% таких зародышей достигли стадии морулы или бластоцисты. Два
зародыша были пересажены второму реципиенту - в матку коровы, и развитие их
завершилось рождением живых телят. Если в качестве доноров использовали ядра
2-, 4- или 8-клеточных зародышей, то реконструированные яйцеклетки не
развивались даже до стадии морулы.
Позже были и более успешные работы. Уиладсин, в частности, сообщил, что ему
удалось получить четырех генетически идентичных бычков холстейнской породы в
результате пересадки в реципиентные яйцеклетки ядер бластомеров одного 32-
клеточного зародыша (рис. 3). Автор утверждал, что большинство ядер
сохраняет тотипотентность на 32-клеточной стадии, а значительная их часть
даже на 64-клеточной стадии, обеспечивая нормальное развитие
реконструированных яйцеклеток до стадии ранней бластоцисты в яйцеводе овцы.
После пересадки в матку коров - окончательных реципиентов, как полагает
автор, они могут и дальше нормально развиваться.
Бондиоли и соавторы, используя в качестве доноров ядер 16-64-клеточные
зародыши коров, трансплантировали 463 реконструированных зародыша в матку
синхронизированных реципиентов, и было получено 92 живых теленка. Семь из них
были генетически идентичны, представляя собой клон, полученный в результате
пересадки ядер клеток одного донорского эмбриона.
Таким образом, клеточные ядра зародышей крупного рогатого скота достаточно
долго сохраняют тотипотентность и могут обеспечить полное развитие
реконструированных яйцеклеток. Иначе говоря, методические трудности
клонирования зародышей крупного рогатого скота практически решены. Но
остается основная задача - найти донорские ядра, обладающие тотипотентностью,
для клонирования взрослых животных.
Клонированию эмбрионов свиней посвящена только одна небольшая работа.
Скудность данных, видимо, и связана с определенными трудностями работы с этим
объектом.
Клонирование овец
Уиладсин еще в 1986 году показал, что и у эмбрионов овец на 16-клеточной
стадии развития ядра сохраняют тотипотентность. Реконструированные
яйцеклетки, содержащие ядра бластомеров 16-клеточных зародышей, развивались
нормально до стадии бластоцисты в перевязанном яйцеводе овцы (в агаровом
цилиндре), а после освобождения от агара и пересадки в матку овцы - второго
реципиента - еще 60 дней. В другом случае донорами служили ядра 8-клеточных
зародышей и были получены 3 живых ягненка, фенотип которых соответствовал
породе овец - доноров.
В 1989 году Смит и Уилмут трансплантировали ядра клеток 16-клеточного эмбриона и
ранней бластоцисты в лишенные ядра неоплодотворенные яйцеклетки овец. В первом
случае было получено два живых ягненка, фенотип которых соответствовал породе
овец - доноров ядер. Во втором случае один полностью сформировавшийся ягненок
погиб во время родов. Его фенотип также соответствовал породе - донору. Авторы
считали, что в ходе дифференцировки эмбриональных клеток происходит инактивация
некоторых важных для развития генов, в результате которой ядра бластоцисты уже
не могут репрограммироваться в цитоплазме яйцеклетки и обеспечить нормальное
развитие реконструированного зародыша. Поэтому, по мнению авторов, в качестве
доноров ядер лучше использовать 16-клеточные эмбрионы или культивируемые in
vitro линии эмбриональных клеток, ядра которых обладают тотипотентностью.
Позднее, в 1993-1995 годах, группа исследователей под руководством Уилмута
получила клон овец - 5 идентичных животных, донорами ядер которых была культура
эмбриональных клеток. Клеточную культуру получали следующим образом: выделяли
микрохирургически эмбриональный диск из 9-дневного овечьего эмбриона
(бластоцисты) и культивировали клетки in vitro в течение многих
пассажей (по крайней мере до 25). Сначала клеточная культура напоминала
культуру стволовых недифференцированных эмбриональных клеток, но вскоре, после
2-3-х пассажей, клетки становились уплотненными и морфологически сходными с
эпителиальными. Эта линия клеток из 9-дневного зародыша овцы была обозначена
как TNT4.
Чтобы донорское ядро и реципиентная цитоплазма находились на сходных стадиях
клеточного цикла, останавливали деление культивируемых клеток TNT4 на
определенной стадии (GO) и ядра этих клеток пересаживали в энуклеированные
яйцеклетки (соответственно на стадии метафазы II). Реконструированные
эмбрионы заключали в агар и трансплантировали в перевязанные яйцеводы овец.
Через 6 дней эмбрионы вымывали из яйцевода первого реципиента и исследовали
под микроскопом. Отбирали те, которые достигли стадии морулы или бластоцисты
и пересаживали их в матку овцы - окончательного реципиента, где развитие
продолжалось до рождения. Родилось 5 ягнят (самок) из них 2 погибли вскоре
после рождения, 3-й в возрасте 10 дней, а 2 оставшихся нормально развивались
и достигли 8-9-месячного возраста. Фенотипически все ягнята были сходны с
породой овец, от которой получали исходную линию клеток TNT4. Это подтвердил
и генетический анализ.
Эта работа, особенно в части культуры эмбриональных клеток, - значительное
достижение в клонировании млекопитающих, хотя она и не вызвала столь шумного
интереса, как статья того же Уилмута с соавторами, опубликованная в начале 1997
года, где сообщалось, что в результате использования донорского ядра клетки
молочной железы овцы было получено клональное животное - овца по кличке Долли.
Последняя работа методически во многом повторяет предыдущее исследование 1996
года, но в ней ученые использовали не только эмбриональные, но еще и
фибробластоподобные клетки (фибробласты - клетки соединительной ткани) плода и
клетки молочной железы взрослой овцы. Клетки молочной железы получали от
шестилетней овцы породы финн дорcет, находящейся на последнем триместре
беременности. Все три типа клеточных культур имели одинаковое число хромосом -
54, как обычно у овец. Эмбриональные клетки использовали в качестве доноров
ядер на 7-9-м пассажах культивирования, фибробластоподобные клетки плода - на
4-6-м пассажах и клетки молочной железы - на 3-6-м пассажах. Деление клеток
всех трех типов останавливали на стадии GO и ядра клеток пересаживали в
энуклеированные ооциты (яйцеклетки) на стадии метафазы II. Большинство
реконструированных эмбрионов сначала культивировали в перевязанном яйцеводе
овцы, но некоторые и in vitro в химически определенной среде.
Коэффициент выхода морул или бластоцист при культивировании in vitro в
одной серии опытов был даже вдвое выше, чем при культивировании в яйцеводе.
(Поэтому, видимо, нет строки необходимости в промежуточном реципиенте и можно
обойтись культивированием in vitro. Однако для полной уверенности в
этом нужны дополнительные данные.)
Выход морул или бластоцист в серии опытов с культурой клеток молочной железы
был примерно втрое меньше, чем в двух других сериях, когда в качестве доноров
ядер использовали культуру фибробластов плода или эмбриональных клеток. Число
живых ягнят в сравнении с числом пересаженных в матку окончательного
реципиента морул или бластоцист было также в два раза ниже. В серии опытов с
клетками молочной железы из 277 реконструированных яйцеклеток был получен
только один живой ягненок, что говорит об очень низкой результативности
такого рода экспериментов (0,36%). Анализ генетических маркеров всех семи
родившихся в трех сериях экспериментов живых детенышей показал, что клетки
молочной железы были донорами ядер для одного, фибробласты плода - для двух и
эмбриональные клетки - четырех ягнят. Овца по кличке Долли развилась из
реконструированной яйцеклетки, донором ядра которой была культивируемая
клетка молочной железы овцы породы финн дорсет и фенотипически не отличается
от овец этой породы, но сильно отличается от овцы-реципиента (рис. 4). Анализ
генетических маркеров подтвердил этот результат.
Успех авторов этой работы, прежде всего, связан с использованием длительных
клеточных культур, так как после многих пассажей в культуре клеток могли быть
отобраны малодифференцированные стволовые клетки, которые, вероятно, и были
использованы как доноры ядер. Большое значение также имел тот факт, что
авторы, учитывая результаты своих предыдущих работ, синхронизировали стадии
клеточного цикла яйцеклеток реципиентов и клеток доноров.
Но вернёмся к клонированию человека. Существует несколько способов обойти
этические проблемы – выращивать отдельные органы из клеток реципиента или
использовать животных. Но это только "косметический" метод. Реальный шаг к
бессмертию - искусственное изменение ДНК. В июне 2000 года и случилось то,
чего так долго ждали и чего некоторые так боялись. Появилось сообщение, что
ученым из уже знаменитой своей овцой Долли шотландской фирмы PPL Therapeutics
Страницы: 1, 2, 3
|