NECA к Р1 пуринорецептору, - высокого в стриатуме (А2а) и
низкого в фибробластах (А2b) (Bruns et al 1986).
2.2.4 Р2 пуринорецепторы
Накопленные фармакологические доказательства, как-то: тип ответа, порядок
активности агонистов, десенситизация, вызываемая АТФ и ее структурными
аналогами, послужили основой для первого субделения Р2
пуринорецепторов. В 1985 году Бернсток и Кеннеди (10) указали на неоднородность
популяции Р2-пуринорецепторов. Этот вывод был сделан исходя из того,
что в некоторых тканях (например продольная мышца слепой кишки) АТФ вызывал
расслабление гладких мышц, а в других (мышечная стенка мочевого пузыря) -
сокращение. Первый подтип рецепторов был обозначен как Р2у, а второй
- Р2х. Для Р2х пуринорецепторов наиболее активным
агонистом был a, b - метилен АТФ (a,b-мАТФ), а для Р2у - 2 -
метилтио АТФ (2-МеSАТP). Так как порядок активности лигандов может зависеть от
скорости их гидролиза до неактивных соединений, которая может значительно
различаться в зависимости от ткани, более четким доказательством для
подразделения Р2 - рецепторов на подтипы служит наличие селективных
блокаторов. Сейчас известны селективные антагонисты как для Р2х, так
и Р2у-рецепторов для Р2х - a,b-мАТФ (десенситизирующее
действие), арилазидаминопропионил АТФ (АНАПП3),
пиридоксалфосфат-6-азофенил-2’,4’-дисульфидная кислота (PPADS), сурамин и
другие; для Р2у пуринорецепторов - реактив голубой 2, сурамин. В
1986 году Гордон (23) предложил выделить из класса Р2
пуринорецепторов еще два подтипа Р2t и Р2z.
Первый рецептор располагается в тромбоцитах и управляет их агрегацией. Он, в
отличие от всех остальных подтипов P2 - рецепторов, активируется
АДФ, и блокируется АТФ. Р2z рецепторы расположены в
тучных клетках. В них АТФ в очень больших концентрациях (> 100 мкМ), а
точнее четырехзарядный анион АТФ4-, вызывал кальцийзависимую
секрецию гистамина. Другие пуриновые нуклеотиды, включая негидролизуемые
аналоги АТФ, не активировали рецептор. Также был обнаружен неселективный
антагонист данного типа рецепторов DIDS - аналог PPADS (Soltoff et al 1993). В
1991 году O’Connor предложил так называемый нуклеотидный рецептор одинаково
чувствительный как к АТФ, так и к УТФ, но не чувствительный к 2 - MeSATP. Этот
рецептор получил обозначение Р2u. Возможным антагонистом
данного рецептора является сурамин. Также было обнаружено, что аденин
динуклеотид полифосфаты также присутствуют в фармакологической периферии (Hoyle
1990). Hildermann (1991) индентифицировал сайт связывания для диаденозин
тетрафосфата ( Ap4A) в мозге крысы, который получил название
дипуринергического рецептора, а позднее Р2d (Pintor et al
1993). Антагонисты данного вида пуринорецепторов пока не обнаружены.
пуринорецепторы | | | Р1 - пуринорецепторы | | Р2 - пуринорецепторы | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | A1 | | A2a | A2b | | A3 | | P2x | | P2y | | P2t | | P2z | | P2u | | P2d | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
Таблица 1. Классическая схема субклассификации пурино-рецепторов.
2.2.5 Реклассификация пуринорецепторов.
Из - за всевозрастающих трудностей и несогласований в классической схеме
классификации Ð2 пуринорецепторов и увеличивающемся числе
подтипов рецепторов, стало очевидным, что классическая схема требует
пересмотра. В 1994 году Abbracchio and Burnstock предложили новую схему
классификации Р2 - пуринорецепторов. Из всех Р2 -
пуринорецепторов они вычленили три основных семейства: Р2Х семейство, связанное
с ионотропными каналами, которое включало четыре подтипа; Р2У - связанное с
активацией G - белков, включающее семь подтипов и семейство Р2Z - семейство
неселективных пор. Их гипотеза основывалась в основном на изучении литературных
источников и анализе фармакологического профиля новообнаруженныж агонистов. В
дальнейшем теория подтвердилась клонированием различных подтипов Р2
- пуринорецепторов. В настоящее время семейство Р2Х насчитывает шесть, а Р2У -
семь подклассов. Благодаря интенсивным исследованиям, практически не остается
сомнений в том, что данные семейства будут расти и дальше (Collo et al 1996).
| Р2 - пуринорецепторы | | | | | | | P2Z - неселективные поры | | | | | | | Р2Х - семейство ионотропных рецепторов | | Р2У - семейство метаботропных рецепторов | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | Р2Х1 | Р2Х2 | Р2Х3 | Р2Х4 | Р2Х5 | Р2Х6 | Р2У1 | Р2У2 | Р2У3 | Р2У4 | Р2У5 | Р2У6 | Р2У7 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
Таблица 2. Современная классификация Р2 типа пуринорецепторов.
3. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Подготовка препарата
Исследования проводились на пирамидальных нейронах моторной области новой коры в
тонких срезах мозга, выделенного из 14 дневных крыс. После декапитации мозг
помещался в холодный солевой раствор (0 - 40С). Процедура от начала
декапитации до выделения мозга длилась не более 60-90 секунд. Затем мозг
закреплялся полиакриламидным клеем на подложке вибротома (Campden, Campden
Instruments LTD, U.K.); камера вибротома заливалась холодным солевым раствором.
Срезы нарезались сагитально толщиной 250 - 300 мкм; скорость подачи лезвия - 1
см/с с частотой 10 Гц. После приготовления срезы помещались в раствор постоянно
насыщаемый карбогеном (5% СО2 + 95% О2). Перед загрузкой
флуоресцентным красителем срезы инкубировались в постоянно оксигенируемом
растворе 30 минут при температуре 32 градуса. Окраска среза осуществлялась в
течении 30 - 35 минут в СО2 насыщенном термостате при температуре 35
градусов. После окраски срезы отмывались 1 - 1,5 часа в постоянно
оксигенируемом растворе при комнатной температуре. Все эксперименты проводились
при температуре 32 градуса.
3.2 Характеристики кальциевого зонда
Для количественного определения концентрации кальция в пирамидальных нейронах
моторной области новой коры использовался краситель Фура-2 AM (рисунок 2)
(16).
На рисунке 3 представлен спектр зонда Фура -2 AM. При связывании с кальцием
происходит характерное изменение спектра возбуждения этого красителя: при
возбуждении светом с длиной волны 390 нм происходит уменьшение флуоресценции, а
при возбуждении светом, с длиной волны 340 нм - увеличение. Однако, 340 нм
является уже ультрафиолетовым светом, и для ее использования необходим
микроскоп с кварцевыми линзами. Поскольку в нашем случае был использован
обычный микроскоп, то вторая волна была выбрана длиной 390 нм. 360 нм - это
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5
|